大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定
摘要：目的：构建大鼠睡眠因子1（Slfn1）基因的发夹状RNA质粒,并进行腺病毒载体包装。方法：根据Rat slfn1基因的转录本设计并合成3个干扰RNA靶点ShRNA-Slfn1（1）、ShRNA-Slfn1（2）及ShRNA-Slfn1（3）,并将单链的引物退火成双链oligo序列,连接入双酶切线性化的RNA干扰载体（p DKD-CMV-U6-shRNA）的U6启动子下游,替换掉原来的ccd B基因;利用Admax系统,将3种目的穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒后进行小量扩增及病毒滴度测定;利用Slfn1过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签,通过Western Blot检测Slfn1过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达,观察靶点质粒对Slfn1表达的影响。结果：经菌落PCR鉴定获得阳性克隆并测序验证正确,表明构建质粒成功;腺病毒包装ShRNA-Slfn1（1）、ShRNA-Slfn1（2）及ShRNA-Slfn1（3）的病毒滴度分别为1.0×10^14ifu/L,2.5×10^14ifu/L,6.3×10^13ifu/L,Western Blot证实ShRNA-Slfn1（1）及ShRNA-Slfn1（3）能显著降低转染293T细胞中Flag的表达,确定shRNA-Slfn1（1）及shRNA-Slfn1（3）为目的质粒。结论：成功构建了大鼠shRNA-slfn1的重组腺病毒载体。
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