新型纳米仿生骨植入材料的生物相容性的初步研究

【摘要】 研究新型纳米仿生骨植入材料的生物相容性。 【方法】 采用骨髓基质细胞体外培养技术，通过ＭＴＴ法检测细胞相对增殖度，对材料的细胞毒性进行分级评价，并采用直接接触培养法，观察细胞在材料上的黏附与散布。 【结果】 材料的细胞毒性分级在０～１之间，骨髓基质细胞可紧密附着于材料表面，黏附生长，并有突起向材料的连通微孔内伸展。【结论】 新型纳米仿生骨植入材料对骨髓基质细胞无毒性作用，符合医用生物材料的安全要求。

【关键词】 仿生 复合材料 骨髓基质细胞 浸提液 生物相容性

Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｂｉｏｎｉｃ Ｓｃａｆｆｏｌｄ ｗｉｔｈ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ

Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｗｉｔｈ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａ ｃｅｌｌｓ （ＭＳＣ） ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ． Ｃｅｌｌ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ （ＲＧＲ） ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＭＴＴ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ａｄｈｅｒｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ ＭＳＣｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｓｐｅｃｉｍｅｎ， ｕｓｉｎｇ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｎｔａｃｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ， ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ＳＥＭ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 Ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｒａｎｋｅｄ ｆｒｏｍ ｇｒａｄｅ ０ ｔｏ ｇｒａｄｅ １． ＭＳＣｓ ａｔｔａｃｈｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ａｄｈｅｒｅｄ ｆｉｒｍｌｙ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ． Ｏｂｖｉｏｕｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｉｅｓ ｓｔｒｅｔｃｈｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ-ｐｏｒｅｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｎｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｈａｖｅ ｎｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ ＭＳＣｓ ａｎｄ ａｃｃｏｒｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｃｕｒｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｂｉｏｎｉｃ； ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ； ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ； ｅｘｔｒａｃｔ ｌｉｑｕｉｄ； ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ

新型生物材料的生物相容性是影响其临床应用的主要因素，材料的孔径形状、大小以及孔隙率对引导细胞的附着、侵润和生长有着重要的作用［１， ２］，由于本实验材料需要植入体内与骨组织紧密接触，因此材料的骨细胞相容性是本研究的主要内容。本实验采用骨髓基质细胞的体外培养技术对新研制的新型纳米仿生骨植入材料（ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ）进行了初步评价，为今后进一步的研究提供实验依据。

１ 材料和方法

１．１ 材料与仪器

新型纳米仿生骨植入材料：３-羟基丁酸-ｃｏ-３-羟基戊酸共聚物／溶胶-凝胶生物活性玻璃 ［ｐｏｌｙ（３-ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ-ｃｏ-３-ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）／ ｓｏｌ ｇｅｌ ｂｉｏａｃｔｉｖｅｇｌａｓｓ，ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ］（华南理工大学材料学研究所提供）。

主要仪器和设备：医用超净工作台、ＣＯ２培养箱、台式离心机、酶联免疫检测仪、倒置相差显微镜（中山三院中心实验室提供）；ＸＬ-３０／ＤＸ-４Ｉ扫描电镜／能谱分析仪（ＰＨＬＩＰＳ）（信息产业部电子五所国防科技重点实验室提供）。

主要试剂和材料：ＤＭＥＭ培养液（Ｇｂｉｃｏ）、胎牛血清（Ｓｉｇｍａ）、胰蛋白酶（ＰＡＡ）、ＭＴＴ（Ｇｂｉｃｏ）等（购自晶美生物制品公司）。

１．２ 实验方法

１．２．１ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料的扫描电镜观察 常规干燥、表面喷金，进行ＳＥＭ检查，直接观察材料的结构、多孔形态、孔径和孔的贯通性。

１．２．２ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料的孔隙率测定

采用常规称量法［３］，计算材料的孔隙率。

１．２．３ 骨髓基质细胞的原代培养及传代

采用全骨髓培养法（直接贴壁法）进行原代培养，取传代生长良好的２ ～ ４代细胞制作细胞生长曲线。

１．２．４ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料浸提液的制备

ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料用环氧乙烷消毒备用，确定材料浸提液的标准浓度为培养液与材料表面积之比：１０ ｍＬ／ｃｍ２，将支架材料浸入完全培养液中，标准条件下（３７ ℃，５％ ＣＯ２，饱和湿度）的培养箱中浸提２ ～ ３ ｄ，吸出浸提液，无菌封存，４ ℃保存备用。同样方法制备８倍、４倍、２倍、１倍、０．５倍、０．２５倍标准浓度的浸提液。

１．２．５ ＭＴＴ法评价材料的毒性分级

根据已绘制的细胞生长曲线，确定本实验的细胞接种浓度和接种的细胞数量，测定不同浸提液浓度分组的细胞相对增殖率（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ，ＲＧＲ），按５级毒性分级法评分：０级ＲＧＲ≥１００％；１级ＲＧＲ≥８０％；２级ＲＧＲ≥５０％；３级ＲＧＲ≥３０％；４级ＲＧＲ≥０。

１．２．６ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料的细胞相容性

将ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料用高糖ＤＭＥＭ完全培养基浸泡３ ｄ，使用前用无菌滤纸吸干，置于２４孔板中。取生长状态良好的第２ ～ ４代培养细胞，调整细胞浓度为５ × １０５／ｍＬ，滴加于材料表面接种于支架材料上，每块材料上接种细胞液２００ ?滋Ｌ，静置３ ｈ后加入培养基至浸没材料。２ ～ ３ ｄ常规换液一次，分别于１ ｄ、３ ｄ、６ ｄ将细胞-材料复合物用２０ ｇ／Ｌ或体积分数为３％戊二醛固定，乙醇逐级脱水，乙酸异内酯置换，临界点干燥，表面喷金后扫描电镜观察。

２ 结 果

２．１ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料的结构

ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料呈白色，略有弹性，表面为泡沫多孔状结构（图１），扫描电镜下见材料为疏松多孔结构，孔隙多并相互联通，孔隙大小约１００ ～ ３００ ?滋ｍ，其中可见纳米级的ＳＧＢＧ颗粒镶嵌或包裹在ＰＨＢＶ基体孔壁上（图２）。

２．２ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料的孔隙率 材料孔隙率的检测结果显示：ε＞ ９０％

２．３ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料的细胞毒性实验

根据培养细胞的生长标准曲线，本研究ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料浸提液进行ＭＴＴ细胞毒性分析的实验分别在１ ｄ、３ ｄ、５ ｄ分三次进行，在细胞培养的开始、进入快速增殖期、以及细胞数量达到极限值之前的三个时间段完成检测。结果见表１，可见各浓度组不同时期的毒性分级均在０～１级之间。 ＳＰＳＳ１１．５统计软件分析研究结果显示：随着材料浸提液浓度的增高，ＯＤ值略有下降，但该变化并不具有显著性差异（Ｐ ＞ ０．０５）；高浓度的材料浸提液对细胞生长的影响与低浓度相比并不存在显著性差异（Ｐ ＞ ０．０５）；随着培养时间的延长各实验组细胞数量都明显增加，１ ｄ、３ ｄ、５ ｄ三个测试时间点上，各浓度组细胞增殖数ＯＤ值与对照组相比无明显差异 （Ｐ ＞ ０．０５）。不同浓度材料浸提液组，在１、３、５天时检测的ＯＤ值变化曲线图显示：各浓度组的ＯＤ值变化与对照组几乎完全重叠。

２．４ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料中细胞黏附和生长形态的观察

细胞培养第１天，可见骨髓基质细胞在ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料表面紧密贴壁生长，呈长梭形或有长突起的扁平多角形，突触舒展明显，相邻细胞胞体相连，并向材料孔隙中伸延（图３Ａ）；细胞培养第３天，可见大量骨髓基质细胞在ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料表面黏附、增殖，胞体呈梭形、多角形，细胞生长密集的地方可见细胞堆积复层生长（图３Ｂ）；细胞培养第６天，仍可见骨髓基质细胞在ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ材料表面黏附、生长，细胞呈不规则形（图３Ｃ）。

３ 讨 论

３．１ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ充填材料的多孔结构与骨的生长

骨再生具有三个基本机制，即骨诱导、骨传导和骨生成。骨传导是指宿主骨床周围的毛细血管和骨祖细胞、成软骨细胞和成骨细胞长入骨缺损区，而植入材料则逐渐被宿主新骨组织替代的过程。研究发现具有类似自然骨的连通微孔结构的材料，可以支持和引导新生骨组织通过互相连通的孔道向材料的丛深生长，为骨组织的再生提供理想的支架结构［４］。孔径、孔隙率以及孔的连通性是评价材料空间结构的几个重要的指标。

本研究采用的ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料为疏松多孔结构，孔径大小为１００ ～ ３００ μｍ，孔隙率 ＞ ９０％。孔隙多且孔孔之间互相连通，有助于新骨组织从材料表面长入内部和血液流通。同时大量的微孔以及较大的比表面积，不仅可使材料体积小，易降解，同时又能获得足够的机械强度，以满足临床治疗的需要。

３．２ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料的ＭＴＴ毒性分析

材料的细胞毒性是评价生物材料与细胞之间相互作用的最重要的指标，而细胞相对增殖度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ， ＲＧＲ）则是材料细胞毒性评估中的一个重要参数［５］。本研究采用ＭＴＴ法来计算细胞ＲＧＲ，并将细胞相对增殖率换算成毒性分级１－５级，来评估实验材料的细胞毒性［６］。研究结果显示随着材料浸提液浓度的增高，ＯＤ值有所下降，但该变化并不具有显著性差异（Ｐ ＞ ０．０５），说明该材料浸提液浓度的提高并不抑制细胞的生长、增殖；随着培养时间的延长，各实验组细胞数量都明显增加，在１ｄ、３ｄ、５ｄ三个测试时间点上，各浓度组细胞增殖数ＯＤ值与对照组几乎完全重叠，高浓度组的材料浸提液对细胞生长的影响与低浓度组相比并不存在显著性差异（Ｐ ＞ ０．０５），说明该材料浸提液的细胞毒性并未出现浓度依赖性，即使是高浓度的材料浸提液在细胞培养的开始、进入快速增殖期、以及细胞数量达到极限值之前的三个具代表性的时间段，都是安全、无毒的；倒置显微镜下可见各组各个时期的细胞呈梭形，伸展充分，形态良好，细胞密度高，生长旺盛，可见大量分裂细胞，与对照组相比，无显著性差异，说明各浓度组的细胞生长良好；各浓度组不同时期的毒性分级均在０～１级之间，说明该材料对骨髓基质细胞无细胞毒性作用，符合生物材料的医用标准。 本研究的ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料共制备了终浓度为８倍、４倍、２倍、１倍、０．５倍、０．２５倍、０．１２５倍标准浓度的７种浸提液，较全面地探讨了该材料浸提液的细胞毒性。同时本研究根据材料植入体内部位和使用目的的要求，选择骨髓基质细胞作为体外培养的实验细胞，更好地模拟出了植入材料在体内骨组织中的真实情况，准确地反映出实验材料的细胞毒性及其与骨髓基质细胞间的相互作用。

３．３ ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ骨植入材料的细胞相容性

观察植入材料与细胞之间的相互作用是研究植入材料细胞相容性的重要内容，采用直接接触的细胞培养法，可以直接观察到细胞在材料表面贴附的情况，一旦材料中有毒性物质释放时，细胞的形态、数量和增殖状态会立即发生变化，为材料的细胞相容性提供最直观的证据，其评价结果客观、敏感和有效［７］。本研究结果显示：骨髓基质细胞能紧密附着于ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料表面，贴附生长，并有突起向材料的连通微孔内伸展，增殖状态良好，结果证实该材料具有优良的细胞亲和性，这可能与材料的结构有关。由于ＰＨＢＶ／ＳＧＢＧ植入材料具有泡沫多孔状结构，具有大小合适的孔径、较高的孔隙率和类似自然骨的连通微孔结构，利于骨髓基质细胞的粘附生长、营养物质的渗入和废物的排出，并促进其在材料上的迁移、分化和增殖。

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