关于超高分子聚乙烯颗粒对体外培养成骨细胞活性的影响

作者：刘林 许铁 秦宏敏 韩会峰

【摘要】 目的 建立小鼠胚胎成骨细胞和超高分子聚乙烯（UHMWPE）颗粒的体外联合培养的新模型，初步研究超高分子聚乙烯颗粒对成骨细胞活性和核心结合因子α1（Cbfα1）表达的影响。方法 分为空白对照组和UHMWPE颗粒干预组，2组常规培养小鼠胚胎成骨细胞，待细胞贴壁后装满培养基，UHMWPE颗粒干预组加入UHMWPE颗粒，封闭倒置培养瓶，颗粒漂浮至贴壁细胞层。 应用流式细胞技术分析各组细胞早期凋亡情况。分别在共培养的第3、5、7天检测细胞Cbfα1在mRNA和蛋白水平上的表达情况。结果 封闭条件下小鼠胚胎成骨细胞正常生长可达10天；UHMWPE颗粒不影响细胞增殖活性，对细胞无明显毒性作用；UHMWPE颗粒干预组的目的基因Cbfα1表达增强。结论 超高分子聚乙烯颗粒可以独立、直接影响成骨细胞相关因子的分泌。 【关键词】 成骨细胞；超高分子聚乙烯颗粒；核心结合因子α1 Abstract： Objective By establishing a new model to co-culture mouse embryo osteoblasts and ultra-high molecular weight polyethylene (UHMWPE) particles in vitro to study the effects of polyethylene on osteoblast activity and related factors′ expression involved in the mechanism of aseptic loosening of arthroprosthesis. Methods The experiment was carried out in a blank control group and a UHMWPE particle intervention group.In the two groups，the embryonic mouse osteoblasts were conventionally cultured， with the culture flask filled with fluid medium after the cells began adhering to the vessel walls， and the flasks inverted and sealed so that the polyethylene particles could contact the cells. After 3， 5 and 7 days of incubation， the expression of Cbfα1 was studied by using semi-quantitative RT-PCR and Western blotting techniques. Results Under closed condition， the cells could keep on normal growth for nearly 10 days. The expression of gene Cbfα1 was increased in the intervention group， compared with the control group. Conclusion UHMWPE particles do not affect the cell proliferation， but can direct independent impacts on the secretive activity of osteoblasts. Key words: osteoblast; UHMWPE particle; Cbfα1 目前，全球每年约有100万关节假体植入，而关节10年失效率几近10％［1-2］。研究显示，磨损微粒引起假体周围界膜的形成和溶骨现象是造成假体松动的主要原因［3］。参与反应的细胞包括单核巨噬细胞、成骨细胞、成纤维细胞等，这些细胞产生各种细胞因子促进破骨细胞破骨，抑制成骨细胞成骨。不同浓度的金属、骨水泥和高分子聚乙烯颗粒等对原代成骨细胞［4］或成骨细胞系［5］无毒性作用，但可以刺激上述细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等各类促进骨质丢失的炎症因子。 常规方法无法使超高分子聚乙烯（UHMWPE）颗粒接触到细胞，本研究应用新的体外培养法直接将UHMWPE颗粒加入到小鼠胚胎成骨细胞培养体系中，观察UHMWPE颗粒对成骨细胞增殖情况和骨相关基因核心结合因子α1（Cbfα1）表达的影响。Cbfα1 属于runt结构域基因家族的转录因子，是细胞因子诱导成骨的共同的信号分子，小鼠两条Cbfα1等位基因缺失后出现肢体短小、全部的骨组织缺损，证实没有成骨细胞。有研究证明了Cbfα1除调节成骨细胞分化外，还控制出生后骨骼的形成和发育过程，在成骨细胞的分化和成熟中起重要作用［6-7］。 1 材料和方法 1.1 实验仪器与材料 1.1.1 主要仪器 CO2孵箱(瑞士Heraeus公司) ，超净工作台(苏州超净设备厂)，离心机(EPPENDORF公司)，紫外分光光度计(日本岛津公司) 。 1.1.2 主要材料 UHMWPE颗粒（中国矿业大学提供，颗粒形态不规则，直径为1.33～98.7 μm），小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，DMEM、胰蛋白酶、PBS缓冲液、青霉素、链霉素等常规实验耗材(南京基天)，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（ACTGene），rnagents总RNA提取系统（Promega），RT - PCR检测系统（Promega），Cbfα1（Santa Cruz公司），辣根过氧化物酶结合的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。 1.2 实验方法 1.2.1 颗粒内毒素的处理 将获得的UHMWPE颗粒溶于75％乙醇，室温下震荡洗浴4次，每次1 h，再用100％乙醇浸泡过夜，消毒后的颗粒放置7天以使残余环氧乙烷消除，处理后的颗粒悬浮浸泡于培养基中4℃ 保存。 1.2.2 细胞常规培养 小鼠胚胎成骨细胞（中国科学院北京细胞生物所提供）常规培养于含10 %胎牛血清、100×103 U/L青霉素、100×103 U/L链霉素的DMEM培养液中（全培），培养条件为37 ℃，CO2 饱和度为5%，定期观察细胞生长情况，每2天用0.25 %的胰酶消化，进行1∶4传代培养。 1.2.3 倒置培养法 实验分为空白对照组和UHMWPE颗粒干预组。待细胞贴壁后向瓶中加满培养基，然后将不同浓度、不同粒径的UHMWPE颗粒加入干预组瓶中并封盖（空白对照组不加任何颗粒），将培养瓶翻转倒置，使粉末贴于细胞生长层面。 1.2.4 应用流式细胞技术分析细胞凋亡情况 分别在第3、5天弃掉培养基并用PBS冲洗细胞表面的UHMWPE颗粒，用不含EDTA的胰酶消化细胞，时间不宜过长，加入1 ml冷的PBS液洗涤2次，1 000 g×10 min离心，弃上清液，调整待测细胞的密度为 5×105～1×106个/ml；将细胞重悬于500 μl Binding Buffer中，同时设立调零组。向每管加入20 μl Annexin V-FITC和5 μl溴化吡啶，轻轻混匀，室温避光反应5 min，上机检测。实验操作重复3次。 1.2.5 总RNA的提取、RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳 分别在细胞培养的第3、5、7天弃掉UHMWPE颗粒和培养基，用PBS冲洗贴壁细胞，用0.25％的胰酶消化细胞，离心后按照RNA试剂盒说明提取总RNA，用1％的琼脂糖进行总RNA电泳，并用无RNA酶水溶解，取出少量稀释后，经紫外分光光度计测定其浓度和纯度，根据测定值调整RNA 标本浓度为1 g/L。半定量检测Cbfaα1和内参GAPDH 的mRNA的表达情况，RT-PCR 反应体系中加入2对引物（具体操作过程参照说明书）。扩增条件:Mg2+115 mmol/L（具体反应条件见表1）。 正常成骨细胞为阴性对照，所有的实验组与对照组重复3次。PCR结束后经2%的琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后拍照，然后进行灰度分析（Image J图像分析软件）并绘制灰度值柱形图。表1 Cbfα1、GAPDH RT-PCR反应条件 1.2.6 Western blotting分析 待融合率达到80%以上时参照Santa Cruz公司蛋白提取方法，应用RIPA 缓冲液裂解成骨细胞得到总蛋白。以牛血清蛋白(BSA) 作为标准品，根据蛋白定量试剂盒(美国Bio-Rad 公司) 说明绘制蛋白定量标准曲线，于分光光度计595 nm下测光密度值，计算提取液蛋白浓度。每一样品取20 μg，以5∶1的体积与5×SDS加样缓冲液混合，100℃加热3～5 min，样品经7.5% SDS-PAGE电泳分离，然后转至硝酸纤维素膜上，5%的脱脂牛奶室温封闭3 h，TBST洗膜3次， 一抗4℃孵育过夜，TBST 洗膜3次， 加入1∶1 000二抗，室温孵育30～60 min，ECL发光显影，薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。所有的实验组与对照组重复3次。电泳后进行灰度分析并绘制灰度值柱形图。 1.3 统计学处理 实验所得数据用x±s表示，利用Sigma Stat 2.03统计软件进行单因素方差分析，多样本均数之间的比较采用q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 细胞的形态学表现 传代的细胞呈梭形或柱形，核染色质较疏松，位于细胞的中央，核仁明显，符合成骨细胞的形态学特征，细胞与UHMWPE颗粒可以在盛满培养基的培养瓶中共存至少1周(图1）。 2.2 流式细胞技术检测细胞早期凋亡结果 空白对照组细胞培养第3、5天细胞凋亡率为0.48％、0.50％，UHMWPE颗粒干预组细胞培养第3、5天细胞凋亡率为0.53％、0.55％，2组比较无统计学意义（P＞0.05），见图2。用Annexin V-FITC和碘化吡啶染色后，正常的活细胞不被Annexin V-FITC和碘化吡啶染色(左下角)；凋亡早期的细胞仅被Annexin V-FITC染色，碘化吡啶染色呈阴性(右下角)；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V-FITC和碘化吡啶染色(右上角)。 2.3 各组RT-PCR结果 与空白对照组细胞相比，UHMWPE颗粒干预组细胞Cbfα1的DNA条带亮度增加（图3），灰度值增加（图4），差异有统计学意义（P<0.05）。 2.4 成骨细胞Cbfα1蛋白的表达 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明UHMWPE颗粒干预组目的蛋白条带亮度较空白对照组增强（P<0.05）（图5）。 3 讨 论 本实验培养的成骨细胞呈贴壁生长，形态均匀一致，胞质透明颗粒少，单个核，具有多数学者报道的形态学特征［8-9］。成骨细胞体外培养为体外研究成骨细胞和骨代谢之间的关系提供了一个体外模型。通过体外培养可以研究植入材料的生物学特性，如生物相容性、生物毒性等，可以研究骨代谢过程中一些激素和细胞因子调节的过程和作用机制［10］。超高分子量聚乙烯(UHMWPE）一般指相对分子质量大于100万的聚乙烯，具有生物相容性、化学稳定性、抗冲击性及耐磨性好和摩擦系数低等优异的性能，作为人工关节窝材料与金属或陶瓷关节头材料组合构成现代人工关节。但是大量研究报道显示，UHMWPE长期应用存在磨损现象，主要有2种磨损方式，一种生成剥离片、粒状碎片，一种生成光滑波纹和微纤。产生的大部分磨屑为0.5～15 μm的粒子和纤维状微粒［11］。Goodman等［12］在对比金属与骨水泥磨屑中发现，超高分子聚乙烯磨屑激活巨噬细胞与成纤维细胞作用最强。临床组织学观察表明［13］：假体周围最常见、数量最多的是UHMWPE颗粒，与假体周围生物学反应的关系较其他颗粒更密切，因此UHMWPE颗粒是引起骨溶解和松动的最主要颗粒，当界膜内超过1×1010/g时，几乎肯定发生骨溶解和松动［14］，假体寿命明显缩短［15］。但UHMWPE颗粒较其他颗粒更容易引起骨溶解的机制尚未揭示。

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