关于胰岛素纳米粒对大鼠实验性糖尿病的降血糖作用

作者：杨彩哲，胡家露，徐梁，吴道澄，张学庸

【关键词】 胰岛素

关键词 :胰岛素;纳米粒;糖尿病，实验性

摘 要:目的 制备氰基丙烯酸正丁酯胰岛素纳米粒（insulin nanoparticles INP），研究其理化特性，观察sc和po给药对糖尿病大鼠的降血糖作用. 方法 用改良的乳液聚合法制备氰基丙烯酸正丁酯胰岛素纳米粒，用透射电子显微镜观察INP的大小、形态，用高压液相色谱法（HPLC）测定其包裹率，用ip四氧嘧啶制备糖尿病大鼠模型.血糖用快速血糖仪测定.用t检验和χ2 检验进行统计学处理. 结果 用改良的乳液聚合法制得的INP粒径为（30±0.5）nm，包裹率为95%，给糖尿病大鼠sc30U・kg-1 ，INP组1h开始起作用，4～6h达峰值，血糖降低98%，作用持续24h，而普通胰岛素组1h达峰值，最大降血糖幅度为55%，作用持续4h.sc20U・kg-1 ，INP组1h开始起作用，4～6h达峰值，最大降血糖幅度为74%，作用持续20h，而鱼精蛋白锌胰岛素组1h开始起作用，4～6h达峰值，最大降血糖幅度为41%，作用也持续20h.给糖尿病大鼠po INP120U・kg-1 ，1d后空腹血糖开始下降，3d效果最佳，血糖降低89%，5～7d后恢复高血糖，而po普通胰岛素组血糖无明显变化，2～4d的血糖两组比较相差显著P<0.05）.50U・kg-1 组及100U・kg -1 组作用持续时间均为5d，120U・kg-1 组的作用时间为7d.三个剂量组最大降糖作用均在服药后3d.120U・kg-1 组与100U・kg -1 组1～5d的BDGP相差显著（P<0.05），100U・kg-1 组与50U・kg -1 组3d时的BGDP相差显著（P<0.05）. 结论 胰岛素包入纳米粒后生物活性保存良好，sc后有缓释作用，po后有降血糖作用.

Keywords:insulin;nanoparticles;diabetes mellitus，experi-mental

Abstract:AIM To investigate the characteristics of insulin-nanoparticles（INP）and their hypoglycemic effect on the al-loxan-induced diabetic rats.METHODS INP was prepared by improved emulsion polymerization methods.The entrap-ment efficiency was measured by HPLC.The diabetic rats were induced by ip alloxan.RESULTS INP thus prepared was（30±0.5）nm in diameter with an entrapment efficiency95%.Subcutaneously administrated INP to alloxan-induced diabetic rats at a dose of30U・kg-1 induced98%decrease of blood glucose at4～6h.The effect lasted for24h.Whereas the regular insulin hypoglycemic effect lasted only for2～3h with the strongest hypoglycemic effect of55%at1h.Subcu-taneously administrated INP at a dose of20U・kg-1 to allox-an-induced diabetic rats induced74%decrease of blood glu-cose at4～6h and the effect lasted for20h.The protamine zine insulin effect lasted for the same time with the strongest hypoglycemic effect of41%at4～6h.When a single dose of INP at120U・kg-1 was given intragastrically（orally）to the diabetic rats，the blood glucose began to drop on the first day，the strongest hypoglycemic effect（about89%decrease of blood glucose）being observed on the third day.The hy-poglycemic effect was maintained for4～5d.After5～7d blood glucose returned to the control values.The regular in-sulin rendered no effect on blood glucose after intragastric ad-minstration（P<0.05）.The dose-dependency was observed in both hypoglycemic effect and maintaining time with differ-ent doses of oral INP.CONCLUSION INP can preserve the biological activities of insulin very well.When subcutaneous-ly administered to alloxan-induced diabetic rats，INP has a prolonged hypoglycemic effect.Oral administration of INP also exerts a dose-dependent hypoglycemic effect on experi-mental diabetes.INP might be of potential oral use for in-sulin.

0 引言

po胰岛素是糖尿病患者的迫切愿望，也是国内外医药工作者研究的热点之一［1-5］ .胰岛素属肽类药物，po后易被胃肠道蛋白水解酶降解，故其po给药问题一直未能解决.纳米粒（nanoparticles NP）是一种直径为10～1000nm，活性成份包封、镶嵌或吸附于粒子之上的胶体分散系统［6］ ，因其具有缓释、靶向性、可提高生物利用度、降低不良反应、可保护肽类药物避免蛋白酶的降解等优点而受到重视［7-14］ ，制备NP的材料有明胶、白蛋白、丙烯酰胺、丙烯酸酯等，近年来氰基丙烯酸酯类（Alkylcyanoacrylates ACA）因具有在水介质中快速聚合、毒性低、可生物降解等优点而倍受青睐［6］ .我们用氰基丙烯酸正丁酯（butylcyanoacrylate BCA）作原料，制备了氰基丙烯酸酯胰岛素纳米粒（insulin-nanoparticles INP），研究其特性，观察po及sc给药对四氧嘧啶糖尿病大鼠的降血糖作用.

1 材料和方法

1.1 材料

胰岛素注射液购自上海生化制药厂，四氧嘧啶购自Sigma公司，氰基丙烯酸正丁酯购自西安实用胶研究所，SD雄性大鼠购自第四军医大学实验动物中心，高压液相色谱仪是日本岛津公司产品，GT-4310型葡萄糖测定仪由桂林医疗电子仪器厂与日本京都株式会社合作生产，JEM-2000EX型透射电子显微镜是日本产品.

1.2 方法

胰岛素纳米粒的制备采用改良的乳液聚合法制备氰基丙烯酸酯胰岛素纳米粒，主要步骤:取蒸馏水60mL，加入0.2g非离子表面活性剂，普通胰岛素溶液20mL（40kU・L-1 ），适量的a-氰基丙烯酸正丁酯（BCA），反应1～2h，得到半透明的胶体溶液，即为胰岛素纳米粒胶体溶液.采用电子显微镜负染法观察纳米粒的大小及形态.用50g・L-1 的醋酸铀溶液染色后，用透射电子显微镜观察（放大4～10万倍）.胰岛素包裹率的测定用高效液相色谱法.胰岛素纳米粒用蒸馏水充分透析后，分别取透析前后的胰岛素等体积，用适量的乙腈溶解INP至透明的溶液，用高效液相色谱仪测定胰岛素含量.层析柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为pH值2.0的0.1mol・L-1 磷酸盐缓冲液与乙腈按7/3比例混合而成的溶液.胰岛素的标准液用上海生化制药厂生产的胰岛素注射液.包裹率=透析后胰岛素浓度/透析前胰岛素浓度×100%.将新制备的胰岛素纳米粒置离心管中，以15000r・min-1 离心60min，观察纳米粒有无分层、聚结或沉淀的现象.4℃放置5mo观 察有无分层、聚结等现象.体质量约200g的SD雄性大鼠，购自本校实验动物中心，在本实验室饲养5d，禁食24h，饮水不限，ip新鲜配制的50g・L-1 四氧嘧啶生理盐水溶液175mg・kg-1 ，分别于给药后1，2，3，7和14d自尾尖取血测定血中葡萄糖浓度.2wk后空腹10h血糖大于16.7mmol・L-1 的大鼠被认为是糖尿病大鼠［3］ .糖尿病大鼠随机分为3组，每组4只，分别sc同等剂量的胰岛素纳米粒（INP）、普通胰岛素（RI）或鱼精蛋白锌胰岛素（PZI），对照组用等量生理盐水（CONTR）.给药后1，2h及其后每间隔2h自尾尖取血，测血糖水平，直至血糖全部恢复至用药前水平.每个血糖值换算为血糖下降百分数（blood glucose decrease percentage BGDP）.

BGDP=用药前血糖值-用药后血糖值用药前血糖值 ×100% 每组各时间点的BGDP用x ±s表示，并用χ2 检验分析每组各时间点与对照组比较差异是否显著.糖尿病大鼠随机分为3组，每组8只，分别用INP，FI及生理盐水（NS）ig.胰岛素的剂量分别为50，100，120U・kg-1 于给药前、后24，48h连续测血糖至给药前水平.每组各时间点的血糖或BGDP用x ±s表示，并用t检验或χ2 检验分析每组各时间点血糖是否差异显著.

2 结果

2.1 INP的特性

用改良的乳液聚合法制得的氰基丙烯酸酯胰岛素纳米粒为园形或卵园形，直径约30nm，形态见Fig1，用HPLC测得的包裹率为95%.普通的胰岛素及INP包裹的胰岛素HPLC的洗脱峰出现时间无明显差异.INP以15000r・min-1 速度离心60min未见分层及沉淀.INP在4℃存放5mo未见分层及沉淀等现象.

2.2 INP的降血糖作用

将INP30U・kg-1 给大鼠sc后1h大鼠血糖开始下降，4h达峰值，最大降血糖幅度为98%，作用持续24h，于用药后24h恢复至用药前水平，sc未包裹的正规胰岛素30U・kg-1 ，血糖在用药后1h下降幅度最大达55%，疗效维持3h，用药后4h血糖恢复至用药前血糖水平.同样剂量（20U・kg-1 ）的INP和PZI给糖尿病大鼠sc后，两组的降血糖作用均在1h起作用，4～6h达到最大降血糖作用，但是两组最大降血糖幅度分别为74%和41%，差异显著（P<0.05，Tab1，2），作用持续时间相同约为20h.给糖尿病大鼠po给药INP120U・kg-1 ，于服药后1d空腹血糖开始下降，3d作用最强，血糖下降率达89%，7d血糖恢复到给药前水平（Fig2）.po等量RI及生理盐水组血糖无明显变化.INP组与RI组比较，2～4d的血糖差异非常显著（P<0.01，Fig2）.不同剂量INP给糖尿病大鼠po后的降血糖作用结果见Tab3. 表1 INP sc30U・kg（略） 表2 INP sc20U・kg（略）表3 poINP对糖尿病大鼠的降血糖作用（略）

3 讨论

我们利用改良的乳液聚合法制备的INP，经HPLC检测，INP中的胰岛素与普通胰岛素HPLC

洗脱峰出现时间是一致的，说明用改良的乳液聚合法 制备的INP中胰岛素的结构未受影响.我们制备的INP包裹率达95%.Zhang等［13］ 用乳液聚合法制备的氰基丙烯酸正丁酯无环鸟苷纳米粒，包裹率仅18%.Damge等［3］ 用界面聚合法得到的INP的包裹率98%，但界面聚合法需大量有机溶剂，工艺复杂.我们建立的改良的乳液聚合法工艺简单易行，便于INP的大规模生产，我们制备的INP直径30nm，比Damage等用界面聚合法得到的粒径为200nm小得多，更易于INP在肠道的吸收. 给糖尿病大鼠sc INP后，有明显的降血糖作用，说明胰岛素包入NP后，胰岛素的生物活性保持良好.INP的降血糖作用与同剂量的普通胰岛素相比，作用时间明显延长.普通胰岛素（30U・kg-1 ）sc给药后1h降糖作用达高峰，作用持续约4h.而同等剂量的INPsc给药后，1h开始起作用，4～6h降糖作用达高峰，作用持续约24h，说明INP有缓释作用.同等剂量（30U・kg-1 ）的RI及INPsc后，最大降糖百分数分别为55%和98%，INP的降血糖作用比同剂量的RI相比明显增强，结果说明INP可以提高生物利用度.RIsc给药，受局部酶类的破坏，因此只是部分发挥降血糖作用.INPsc后，其中的胰岛素受NP的保护，避免局部酶类的降解，使进入体内的INP充分发挥降血糖作用.INPsc给药后，随着剂量的加大，INP降血糖作用加强，作用时间也显著延长.Damge等［3］ 用氰基丙烯酸异丁酯制得INP，以25U・kg -1 给糖尿病及正常大鼠sc，其降血糖效果可以持续20～22h，随着剂量的增大，降血糖作用也增强，作用时间也明显延长.本结果与文献一致.INPsc后，其作用时间明显延长，可能是由于纳米粒中被包裹胰岛素缓慢释放.Damge等及Couvreur［6］ 认为是由于酯酶对聚氰基丙烯酸酯的酯侧链水解引起的生物降解，使包裹的药物逐渐自INP中释放出来.Lavelle［14］ 也认为被包裹的药物通过纳米粒上的孔隙，被动弥散出来.

INP按120U・kg-1 给糖尿病大鼠ig，于服药后1d空腹血糖开始下降，2d降至正常，3d达到最大疗效，降血糖幅度达89%，维持正常血糖3d，7d血糖恢复给药前水平，而po等量普通胰岛素及生理盐水组血糖无明显变化，说明包入NP的胰岛素给糖尿病大鼠po后，能逃避胃肠道蛋白分解酶的破坏，直接被肠道吸收，发挥降血糖作用.有作者［10］ 曾将胰岛素吸附在NP表层，给大鼠po，无降血糖作用.Damge等［3］ 将直径为200nm的INP以100U・kg-1 给糖尿病大鼠po，其降血糖幅度约59%，作用维持22d.我们将直径为30nm的INP一次给大鼠po100U・kg－1 ，其最大降糖幅度为74%.这可能是由于小的INP降解过程所需时间比大的INP要短，而使胰岛素释放在相对较短时间内较集中完成.

关于INP在胃肠道的吸收机制尚未阐明，有作者认为［4］ NP进入肠腔后，释放胰岛素至肠腔，多数在肠腔内被酶类降解，少数被吸收进入体循环而发挥作用.William等［5］ 认为胰岛素进入胃肠道后，可能与胃肠道上皮细胞表面的胰岛素受体结合，而减少葡萄糖在肠道的吸收，使血糖下降的.多数学者［3，6，12］ 认 为纳米粒可以完整吸收.胃肠道摄取INP有三种可能的途径［6］ :①被肠上皮细胞摄取至细胞内;②通过细胞间转运;③经Peyer’s结的M细胞的摄取.纳米粒在胃肠道的吸收除了与粒径的大小、组成成分、表面的亲水性、表面电荷等粒子本身的特性有关外［15］ ，还受其他因素影响，最近有学者［16，17］ 发现用维生素B12修饰后，可以促进纳米粒吸收.血管内皮细胞生长因子可以促进血管对纳米粒的跨细胞转运［18］ ，进一步研究INP在胃肠道的吸收机制，设计po生物利用度高的胰岛素剂型，争取早日进入临床.

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