超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法分析

【摘要】 目的： 使用超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO）对成肌细胞进行体外标记，探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响. 方法： 常规方法进行成肌细胞培养，应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞，用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响，台盼蓝染色及JC1观测SPIO对细胞活力的影响. 结果： 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒，单纯SPIO标记有效率为50%，脂质体包被的SPIO标记有效率为100%，电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒. SPIO标记对细胞无毒性，不影响细胞的增殖及活性. 结论： 脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒，可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究. 【关键词】 成肌细胞 超顺磁性氧化铁 磁共振成像 0引言 生物治疗是改善和缓解终末期缺血性心脏病的理想手段，其中以细胞移植最有临床应用前景［1］. 但需要解决一个重要问题是植入细胞的存活、迁移如何识别和动态监测. MR显微成像是最近出现的显微影像技术，具有较高的分辨率，能够分辨近似于细胞大小的组织［2］，理论上能够动态跟踪移植细胞. 但目标细胞必须经MR对比剂标记后才能与背景组织区别而被MR检测到. 超顺磁性氧化铁纳米粒子（superparamagnetic oxide iron particle， SPIO）是一种新型磁共振对比剂，本研究我们探讨SPIO标记成肌细胞方法及其对细胞增殖分化的影响，为临床利用MRI技术无创监测移植细胞在心脏内的存活和迁移奠定基础. 1材料和方法 1.1材料 SD乳大鼠. DMEM培养基， 小牛血清(FBS)， 脂质体2000， JC1（Molecular probes）均为美国Gibco公司产品. Endorem：超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO市售制剂，11.2 mg Fe2+/mL），由荷兰鹿特丹Erasmus大学医学中心放射线科张卓立博士后提供. CO2培养箱、光学显微镜、荧光显微镜及透射电镜. 1.2方法 1.2.1成肌细胞分离培养 将出生3 d以内的SD大鼠颈椎脱位法处死， 无菌条件下取双下肢肌肉， DHanks液洗去残血，祛除筋膜等周围组织，用含抗生素的无血清培养液冲洗2次，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小肌肉碎块， 无血清培养液冲 洗2次， 静置1 min并去上层液及飘浮组织. 加5倍体积2 g/L Ⅰ型胶原酶，37℃ 水浴消化50 min， 2000 r/min离心10 min，去上清液，底层细胞和碎片用DMEM洗2次，制成骨骼肌单细胞悬液，再加5倍体积2.5 g/L胰蛋白酶，37℃ 水浴消化30 min，释放位于骨骼肌肌膜的成肌细胞，加入150 mL/L FBS的DMEM培养液8 mL阻止酶消化，2700 r/min离心10 min，去上清，重悬细胞离心去上清，反复4次，最后一次用2 mL不含FBS的DMEM重悬细胞，采用Percoll（细胞分离液）非连续密度梯度离心法除去成纤维细胞，将所得细胞加入150 mL/L FBS的DMEM培养基中，吹匀、计数，接种于内置处理过的盖玻片的培养板中. 1.2.2脂质体包被SPIO方法 30 μL脂质体2000稀释于0.5 mL OptiMEM血清培养基中为管1，总量含112 μg Fe2+的Endorem(SPIO)稀释于0.5 mL OptiMEM血清培养基中为管2， 5 min后混合管1及管2并室温放置20 min，获得脂质体包被SPIO的混悬液. 总量含112 μg Fe2+的Endorem稀释于1 mL OptiMEM血清培养基，获得单纯SPIO的混悬液. 1.2.3SPIO标记 成肌细胞提取传代（第2代）后第2日生长较活跃的成肌细胞，将单纯SPIO混合液及脂质体包被SPIO混合液分别加入含1×106成肌细胞的9 mL OptiMEM中（11.2 μg Fe2+/mL），37℃， 50 mL/L CO2培养箱中共同培养23 h，即可得标记成肌细胞. 1.2.4SPIO标记的检测 ① 光学显微镜检测： 利用普鲁氏兰可使SPIO铁离子染色并在普通光学显微镜下可以观察到的特点，用普鲁氏兰对SPIO标记的成肌细胞及脂质体包被SPIO标记的成肌细胞进行染色. 具体方法为：将标记成肌细胞移入内置处理过的盖玻片的六孔培养板中. 1 h后待细胞充分贴壁后，取出盖玻片，DHanks液洗涤3遍，40 g/L多聚甲醛固定20 min，蒸馏水洗涤2遍，Perls反应液（等体积200 mL/L盐酸与100 g/L亚铁氰化钾新鲜配制）染色20 min，蒸馏水洗涤2遍，5 g/L伊红复染3 min，蒸馏水洗去多余的伊红，光学显微镜观察SPIO在细胞内的位置、标记率，每个样本进行多视野计数至少500个细胞. ② 电镜检测：消化收集标记移植细胞，吸去培养基后以25 mL/L戊二醛4℃固定15 min，离心（2000 r/min， 10 min）收集细胞，25 mL/L戊二醛、10 mL/L锇酸固定. 梯度乙醇脱水、包埋，超薄切片，铀铅双染，透射电镜观察并摄片. 1.2.5细胞分化增殖及传代对SPIO标记的影响 标记细胞分别于标记后0， 1， 4， 8 d及细胞传代后，进行普鲁氏兰染色，按上述方法进行光学显微镜检测，观察SPIO的标记率及含量. 1.2.6SPIO对成肌细胞的影响 ① MTT法检测成肌细胞活力： 将消化标记及未标记成肌细胞悬液分别接种于24 孔细胞培养板，加完全培养基放入培养箱进行培养，分别于0， 1， 4， 8 d取标记及未标记细胞各1 孔，经台盼蓝染色，计数细胞总数和活细胞数，计算存活百分率，每一时相设4个复孔，取平均值. ② JC1染色检测线粒体膜电位：于0， 1， 4， 8 d时，SPIO标记细胞及未标记细胞经胰蛋白酶消化后，取单细胞悬液，用PBS调整细胞至1×109/L加入JC1，使JC1终浓度为0.5 mg/L，室温避光10 min，离心1000 r/min， 5 min，弃上清. 用400 μL的PBS液重悬，立即通过荧光显微镜进行检查，计数发绿光（死亡细胞）的细胞数及总细胞数，计算死亡百分比. 统计学处理： 所测数据采用SPSS10.0软件进行统计学分析，计量数据以x±s表示，两组间均数比较用t检验，P<0.05认为有统计学意义. 2结果 2.1SPIO标记普鲁氏兰染色证实标记成肌细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒，大部分的铁聚合物包绕在细胞核周围（图1A），而细胞核内或细胞外则未检测到. 单独用SPIO标记的细胞只有大约50%的标记率，而用阳离子脂质体包被的SPIO可100%标记成肌细胞(图1B). 2.2标记成肌细胞电镜观察电镜观察标记成肌细胞内可见铁粒子，标记细胞质膜下可见大小不一的空泡状结构，高密度的铁粒子存在于空泡内外（图2）. 2.3细胞分化增殖及传代对SPIO标记的影响分别于标记后0， 1， 4， 8 d进行观察，可见100%细胞内仍有SPIO离子，但SPIO含量随时间的延长而减少. 细胞传代后SPIO标记率下降，但传代3次后普鲁氏兰染色证实细胞标记率仍高达90%. 2.4SPIO对成肌细胞活力的影响① MTT法检测成肌细胞活力： 在标记后0， 1， 4， 8 d，MTT检测SPIO对成肌细胞存活率的影响，显示标记及未标记SPIO的成肌细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05，表1). ② JC1染色检测线粒体膜电位的改变：荧光探针JC1是一种亲脂性荧光素，可自由穿过细胞膜选择性地进入线粒体，单体时525 nm激发出绿光，聚集时590 nm激发出红光，但是线粒体去极化时，由于JC1进入线粒体内减少，不能形成聚集，致使红/绿荧光强度的比例下降，甚至呈现单一的绿色. 红绿光比值是反映细胞毒性及活性的重要指标. 本实验荧光显微镜观察结果表明，在各时点标记细胞及未标记细胞的表面大多呈均匀的红色荧光，显示绿色荧光的细胞均较少，两组细胞在各时点发绿色荧光细胞数的差异无统计学意义（P>0.05）. 表1SPIO 对成肌细胞活力的影响(略) 3讨论 各种原因心脏病所致心肌损伤的共同特点是具有完整舒缩功能的心肌细胞数量相对或绝对减少，受损心肌细胞由纤维组织瘢痕修复，未受损的心肌细胞肥大，部分失去代偿功能，最终将发展成心功能衰竭，增加具有完整舒缩功能的心肌细胞数目是有效治疗心肌损伤的关键，多个研究提示干细胞移植可以改善受损心肌功能［1］. 其中成肌细胞移植是常用的方法. 但是干细胞在移植到心脏后，是否就在疾病病变部位？数量上有无变化？其增殖分化情况如何？因此，移植细胞要进行监测，以便跟踪其生长分化状态. 要进行监测则细胞移植前要进行标记，理想的标记物应具备以下条件： ① 高标记率. ② 细胞分化状态下不能改变细胞内标记物的表达. ③ 细胞在体内发育过程中能维持稳定的标记物含量. ④ 能够无创在体动态监测. 目前常用的标记方法有： 3HThymidine标记法、 β半乳糖酐酶基因（Lacz）转染细胞标记法、荧光标记法等，但均不能满足以上所述理想标记物的要求. 这些方法虽有较高的标记率，但最大的问题是无法在活体内显示标记细胞，只能是组织学方法［3］，这些方法的评价都只能在死后的尸检中进行. 因此急需发展新的非侵入性的显像方法来评价心肌对干细胞治疗的反应.

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