关于多柔比星透明质酸纳米颗粒对口腔鳞状细胞癌作用

作者：张晓燕 金晓明 刘晨光

【摘要】 目的 探讨多柔比星透明质酸纳米颗粒于体外靶向杀伤口腔鳞状细胞癌的作用。方法 在体外培养的口腔鳞状细胞癌细胞中分别加入多柔比星浓度为0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L的多柔比星透明质酸纳米颗粒，利用体外细胞毒实验四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测多柔比星透明质酸纳米颗粒对肿瘤细胞的靶向杀伤作用；多柔比星浓度为5.0、10.0 mg/L时分别作用0、6、12、24、48 h后，利用流式细胞仪检测其对肿瘤细胞凋亡影响。结果24、48 h 细胞毒实验显示，多柔比星透明质酸纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤作用优于游离多柔比星(t=5.78～42.05，P<0.01)。相同浓度多柔比星透明质酸纳米颗粒细胞凋亡百分率随时间延长而升高（F=4 200.40、4 775.36，P<0.01），相同作用时间细胞凋亡率随浓度增加而升高（t=12.06～20.08，P<0.05)。结论 多柔比星透明质酸纳米颗粒可特异性识别肿瘤细胞，并实现其杀伤作用，而且随时间延长杀伤作用增大。 【关键词】 多柔比星；纳米结构；肿瘤，鳞状细胞；药物释放系统;药物疗法 多柔比星（ADM）是临床常用的抗恶性肿瘤药，但长期使用有很强的毒性作用[1]。纳米生物材料可大大提高药物载体的靶向性， 降低药物的毒副作用[2]。将透明质酸（HA）与多柔比星联合制成纳米颗粒，可通过HA与透明质酸结合受体（RHAMM）及CD44的特异结合实现药物的特异投放，从而提高药物的靶向性，降低药物的毒副作用。本研究旨在探讨多柔比星透明质酸纳米颗粒（AHAN）于体外靶向杀伤口腔鳞状细胞癌的作用。 1 材料与方法 1.1 材料来源 人口腔鳞状细胞癌细胞株由上海第九人民医院陈万涛教授惠赠，AHAN由刘晨光教授惠赠。 1.2 仪器与试剂 1640培养基（上海卓康生物科技有限公司），新生小牛血清（中国杭州四季青生物工程公司），注射用多柔比星（每瓶10 mg，浙江海正药业股份有限公司），胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma公司），倒置相差显微镜（日本奥林巴斯公司），Rainbow酶联免疫酶标测定仪（奥地利Tecan公司），流式细胞仪（美国BD公司）。 1.3 方法 1.3.1 细胞的培养 将口腔鳞状细胞癌细胞接种于含体积分数0.10小牛血清的RPMI 1640 培养基中，置于37 ℃、体积分数0.05的CO2孵箱中培养，用胰酶消化传代。取对数生长期的细胞用于实验。 1.3.2 AHAN溶液配制 细胞加药前取1 mg的AHAN溶于1 mL双蒸水，浸泡24 h，超声粉碎颗粒，此时ADM浓度为156 mg/L，高压灭菌备用。 1.3.3 细胞形态学观察及MTT比色法培养 将检测细胞以5×107/L 接种到96 孔培养板中，每孔均为0.1 mL，待细胞生长融合为单层后， 分别加入AHAN（AHAN组）、游离ADM（游离ADM组） 和RPMI 1640工作液(空白对照组)，AHAN、ADM组按ADM浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L设4组，每组设4个平行组。空白对照组加等量RPMI 1640工作液。分别培养24、48 h 后于倒置显微镜下观察细胞形态的改变。MTT 法计算存活率，细胞存活率＝试验组吸光度值/对照组吸光度值×100％，测定波长为570 nm。 1.3.4 流式细胞仪测定细胞凋亡率 将细胞以1×108/L接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分别将5、10 mg/L的HAADMSSL作用于细胞0、6、12、24、48 h后，将细胞用2.5 g/L胰酶EDTA消化、离心收集，0.01 mol/L PBS （pH 7.4）洗2次，3 000 r/min 离心5 min，体积分数0.70冷乙醇固定细胞，加含RNA酶PI染液4 ℃作用30 min，过网，调细胞浓度至109/L，流式细胞术检测细胞凋亡率。 1.4 统计学处理 采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[3]统计分析软件对数据进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。 2 结果 2.1 各组细胞形态的变化 加药24 h后，空白对照组细胞形态无明显变化；游离ADM组和AHAN组均可见部分鳞状细胞癌细胞收缩，细胞变小变圆，有突起相互牵连，在细胞表面出现多数暗色颗粒，AHAN组同时可见细胞散在脱落。加药48 h后，游离ADM组可见细胞多数收缩， AHAN组可见细胞几乎完全脱落，呈散在存在。 2.2 各组细胞存活率比较 培养24、48 h两组相同浓度细胞存活率比较差异有显著性(t=5.78～42.05，P<0.01)。见表1。 2.3 流式细胞术检测 相同浓度的AHAN细胞凋亡率随时间延长而升高（F=4 200.40、4 775.36，P<0.01），浓度为5.0、10.0 mg/L作用0 h两组间细胞凋亡率无显著差异（t=0.20，P>0.05），分别作用6、12、24、48 h两组凋亡率差异有显著性（t=12.06～20.08，P<0.05）。见表2。 表1 两组培养24、48 h细胞存活率比较（略） 表2 不同浓度的AHAN对口腔鳞状细胞癌细胞凋亡率的影响（略）

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