基于Sol-gel膜和多壁碳纳米管/铂纳米颗粒增效的电流型L-乳酸生物传感器

作者：贺晓蕊 于京华 葛慎光 张秀明 林青朱晗 封烁 袁靓 黄加栋

【摘要】 构建了基于多壁碳纳米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）和铂纳米颗粒（Pt-nano）的电流型L-乳酸生物传感器。将Sol-gel膜覆盖在L-乳酸氧化酶（L-lactate oxidase，LOD）和MWCNTs/Pt-nano修饰的电极表面。实验结果表明：传感器的最佳工作条件为：检测电压0.5 V；缓冲液pH 6.4；检测温度25 ℃。此传感器的响应时间为5 s， 灵敏度是6.36 μA/（mmol/L）。连续检测４星期其活性仍保持90%，线性范围为0.2~2.0 mmol/L，且抗干扰能力强。在实际血样的检测中，此传感器与传统的分光光度法具有很好的一致性。

【关键词】 生物传感器； L-乳酸； 溶胶-凝胶； 铂纳米颗粒； 多壁碳纳米管

Abstract An electrochemical L-lactate biosensor was fabricated by combining Platinum nanoparticles(Pt-nano) with multi-walled carbon nanotubes(MWCNTs).L-lactate oxidase(LOD) was immobilized on the surface of the glassy carbon electrode(GCE) modified with MWCNTs and Pt-nano.The surface of resulting LOD/MWCNTs/Pt-nano electrode was covered by a thin layer of sol-gel to avoid the loss of LOD and to improve the anti-interference ability.The cyclic voltammetric results indicated that MWCNTs/Pt-nano catalyst displayed a higher performance than MWCNTs.Under the optimized conditions，i.e.，applied potential of 0.5 V，pH 6.4，25 ℃，the proposed biosensor’s determination range was 0.2－2.0 mmol/L，response time was within 5 s，and the sensitivity was 6.36 μA／（mmol/L）.It still kept 90% activity after 4 weeks.The fabricated biosensor had practically good selectivity against interferences.The results for whole blood samples analyzed by the present biosensor showed a good agreement with those analyzed by spectrophotometric method.

Keywords Biosensor； L-lactate； Ｓol-gel； Ｐlatinum nanoparticles； Ｍulti-walled carbon nanotubes

1 引言

临床医学、牛奶工业、葡萄酒工业、生物技术和运动医学等领域都需要灵敏、快速的L-乳酸检测方法。特别是血乳酸水平能够反映人体的多种病理状态。传统的L-乳酸的检测主要采用分光光度计法〖1〗。但这种方法过程复杂、成本高。生物传感器因其选择性高、响应快和重复性好等优点被认为是最适合的生化分析仪器之一。目前，关于检测乳酸含量的电化学传感器已有报道〖2，3〗。但简便、便宜和选择性高的L-乳酸传感器依然是目前研究的热点。

碳纳米管（Carbon nanotubes，CNTs）拥有许多特殊性质，如高电导性、高化学稳定性，以及非常高的机械强度和系数〖4，5〗。CNTs包括单壁碳纳米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）和多壁碳纳米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）。当被用作电化学反应的电极材料时，SWCNTs和MWCNTs都有提高电子转移反应的能力。研究表明：MWCNTs可增强电极表面的电催化活性和增大其表面积〖6〗。文献〖7～９〗表明：CNTs修饰的电极能够显著增强儿茶酚胺神经传递素、细胞色素C、抗坏血酸、NADH和肼复合物的电化学性能。CNTs能够提高NADH和H2O2的电子转移反应，这表明它在基于脱氢酶和氧化酶的电流型生物传感器方面有广阔的应用前景〖１０〗。铂纳米颗粒（Patinum nanoparticles，Pt-nano）是一种有效的酶传感器的构建材料。它具有很好的生物相容性、大的表面积及对H2O2的催化能力强〖11〗。

本研究构建了基于MWCNTs和Pt-nano的电流型L-乳酸生物传感器。为阻止电极表面上的酶分子的丢失和提高传感器的抗干扰能力，采用Sol-gel膜〖12，13〗覆盖LOD/MWCNTs/Pt-nano电极表面。对构建的生物传感器的检测范围、响应时间、敏感性和稳定性进行了研究。考察了pH值、电位、温度和电活性干扰物对传感器电流的影响， 并将此传感器应用于全血分析。

2 实验部分

2.1 试剂与仪器

L-乳酸氧化酶（LOD，E.C.1.1.3.2，34 units/mg，from Pediococcus species）、二甲基亚砜（DMＳＯ）、正硅酸四乙酯（TEOS，99%）、Triton X 100均购自Sigma公司；L-乳酸、L-乳酸锂购自Fluka公司；多壁碳纳米管（MWCNTs，直径约15 nm，纯度95%，中科院成都有机化学研究所）；氧化铝粉末（Merck公司）；H2PtCl6·6H2O（天津市第二化学试剂有限公司）；磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L KH2PO4，0.05 mol/L K2HPO4，0.1 mol/L KCl）作为支持电解质。其它试剂均为分析纯，无需纯化直接使用。实验用水为去离子水。电化学测试在283电化学工作站（EG & G，USA）上进行，使用270软件。采用传统的三电极体系：Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修饰的玻璃碳电极（Glass carbon electrode，GCE，Φ=3 mm）作为工作电极，铂片作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极。电流的测定是在搅拌的条件下进行的。

2.2 Sol-gel标准溶液、纳米铂溶液和MWCNTs标准溶液的配制

在烧杯中按照一定的比例加入TEOS，H2O和0.1 mol/L HCl，不停地搅拌该混合溶液直到溶液变清澈，即得Sol-gel储备溶液。此储备溶液被应用于整个实验中，并可根据需要对其进行稀释。

根据文献〖14〗制备Pt-nano溶液。将4 mL 5% H2PtCl6·6H2O溶液加入到340 mL蒸馏水中，在80 ℃下边搅拌边加热。加入60 mL 1%柠檬酸钠溶液后，在（80±0.5） ℃保温4 h。此过程通过吸附光谱记录。当PtCl２－6的吸附带消失的时候， 表明反应结束。

图1 Pt-nano的TEM图（放大倍数100000）（略）

Fig.1 Transmission electron micrograph of platinum nanoparticles(Pt-nano)(×100000)

将2 mg MWCNTs加入到1 mL二甲基亚砜溶液中，超声搅拌，制备成黑色悬浊液状的MWCNTs溶液。

2.3 制备Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修饰的酶电极

用0.05 μm Al2O3粉打磨玻碳电极，超声清洗，再分别用1 mol/L HNO3和1 mol/L NaOH清洗，然后用双蒸水彻底清洗。20 μL MWCNTs和20 μL铂纳米颗粒混合制成贮备溶液，超声40 min，得到均匀分散的MWCNTs和Pt-nano溶液。

将10 μL MWCNTs和Pt-nano溶液滴加到玻璃碳电极的表面，使之均匀分布在电极的整个表面上，然后将电极在室温下干燥30 min。再用2 μL LOD溶液覆盖MWCNTs和Pt-nano复合膜修饰的电极表面。在室温下干燥20 min后，加6 μL Sol-gel储备溶液到酶层的表面，然后在室温下干燥。最后，将酶电极浸入到pH 6.8的缓冲液中，保存在4 ℃的冰箱中过夜，以便除去电极表面过量的L-乳酸氧化酶。用去离子水彻底清洗电极，即得Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修饰的电极。

3 结果与讨论

3.1 Sol-gel/LOD/MWCNTs/Pt-nano修饰电极的电化学特性

研究了MWCNTs/Pt-nano和MWCNTs修饰的电极对L-乳酸的电催化行为。由图2可见，MWCNTs/Pt-nano和MWCNTs都能增加传感器的电流响应。 图2 裸电极(a)、MWCNTs修饰的电极（b）、MWCNTs/Pt-nano修饰的电极(c)的CV图（略）

Fig.2 Cyclic voltammograms of L-lactate on bare GCE(a)，MWCNTs modified electrode(b)，MWCNTs/Pt-nano modified electrode(c)

1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)，扫描速率(Scanning rate) 50 mV/s，0.1 mol/L PBS，电压（Polential） 5 V，pH 6.4.但是MWCNTs/Pt-nano修饰的电极显示出比MWCNTs修饰的电极有更好的电流增效作用。由图2中曲线b和c可见，MWCNTs/Pt-nano修饰的电极对L-乳酸的电催化活性比MWCNTs修饰的电极强。因为MWCNTs/Pt-nano修饰电极的电化学性能得到了提高，电子能够更容易快速地在酶和MWCNTs/Pt-nano层之间传递。

3.2 pH值对传感器响应的影响

研究了pH值在5.6~8.0范围内变化对传感器电流响应的影响（图3）。不同pH值的L-乳酸标准溶液的浓度均为1 mmol/L。实验表明： pH<6.4时，传感器的响应电流随着pH值的增大而显著增大； pH=6.4时，传感器的响应电流达到最大；pH>6.4时，传感器的响应电流下降。本实验选择pH 6.4的缓冲液作为检测L-乳酸的缓冲液。

3.3 温度对传感器响应的影响

在pH 6.4的缓冲液中，研究了5~50 ℃范围内温度对传感器响应电流的影响（图4）。在5~25 ℃范围内，随着温度的提高，传感器的响应电流逐渐增大; 在25 ℃条件下，反应达到最大值; 然后随着温度的提高，传感器的响应电流快速下降，这可能是因为高温使酶变性造成的。在较高的温度下，蛋白质的三维结构被破坏，酶分子的构象被打开，从而失去了活性〖15〗。

图3 缓冲液pH值对传感器响应的影响（略）

Fig.3 Effect of pH of buffer solution on response of biosensor

1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)； 0.1 mol/L PBS； 0.5 V. 图4 温度对传感器响应的影响（略）

Fig.4 Effect of temperature on response of biosensor

1 mmol/L L-乳酸(L-lactate)； 0.1 mol/L PBS； pH 6.4； 0.5 V.

3.４ 电流反应和工作曲线

在上述优化条件下，探讨生物传感器对L-乳酸的响应。实验在搅拌的0.1 mol/L pH 6.4的缓冲液中进行。图5a和图5b分别为在未加入Pt-nano（A）和加入Pt-nano（B）的情况下酶电极的电流响应的标定曲线。实验结果表明：修饰有MWCNTs/Pt-nano的电极的电流响应高于只修饰有MWCNTs的电极。修饰有MWCNTs的电极达到95%信号的响应时间小于15 s。传感器反应的线性范围是0.25~2.0 mmol/L; 灵敏度是3.99 μA/(mmol/L); 相关系数为0.989; 检出限为0.01 mmol/L（S/N=3）。修饰有MWCNTs/Pt-nano的电极达到95%信号的响应时间小于5 s。传感器反应的线性范围是0.2~2.0 mmol/L; 灵敏度是6.36 μA/(mmol/L); 相关系数是0.999; 检出限是0.3 μmol/L（S/N=3）。上述结果表明：Pt-nano能显著提高传感器的性能。

图5 MWCNTs/Ptnano/GCE(a)和MWCNTs/GCE(b)修饰的传感器的电流随葡萄糖浓度的工作曲线及其线性相关点（略）

Fig.5 Linear correlation points of Calibration plots and I-c curves for the MWCNTs/Ptnano/GCE(a) and MWCNTs/GCE(b)

0.1 mol/L PBS (pH 6.4) at 0.5 V vs.Ag/AgCl．

与其它基于Sol-gel的的方法构建的L-乳酸传感器〖16~18〗相对比，结果表明：本研究构建的L-乳酸传感器具有较大的响应电流、较低的检出限，表明Pt-nano结合MWCNTs提高了传感器的电化学性能。

3.5 抗干扰性

在干扰物各自生理浓度水平上考察了其对L-乳酸响应的干扰。在0.5 mmol/L L-乳酸溶液中，对其含有的对乙酰氨基酚（0.13 mmol/L）、葡萄糖（5.45 mmol/L）、尿酸（0.35 mmol/L）、抗坏血酸（0.055 mmol/L）、半胱氨酸（0.015 mmol/L）进行检测(见表1)。结果显示：对乙酰氨基酚、葡萄糖、尿酸、抗坏血酸、半胱氨酸对L-乳酸的测定几乎没有影响。说明此传感器具有很好的抗干扰能力。原因是MWCNTs/Sol-gel修饰的玻璃碳电极降低了H2O2氧化还原过电位。

表1 L-乳酸检测中可能的其它底物的干扰(0.1 mol/L PBS pH 6.4) （略）

Table 1 Possible interferences from other substrates for L-lactate determination (0.1 mol/L phosphate buffer at pH 6.4)

电流比率(Current ratio)=IL+I/II。其中IL+I和IL分别为干扰物存在和无干扰物的情况下L-乳酸的响应电流(IL+I is the response current of L-lactate in the presence of interference.IL is the response current of L-lactate)。0.5 mmol/L L-乳酸(L-lactate).

3.6 传感器的重复性和稳定性

用同一传感器对0.5 mmol/L L-乳酸溶液连续检测5次，相对标准差是0.4%；用5个传感器对0.5 mmol/L L-乳酸溶液进行检测，相对标准差是2.0%。以上结果表明，构建的传感器具有很好的重复性。

每隔5 d测定一次传感器对０．5 mmol/L乳酸溶液的响应值。当传感器不用时，储存在0.1 mol/L PBS溶液（pH 6.8）中，室温放置。连续检测4星期以后，传感器的响应值仍保持在最大响应值的90%，表明此传感器具有很好的稳定性。

3.7 人血样中L-乳酸的临床检测

在最适条件下，应用此传感器检测人血样中L-乳酸，对其实际应用性能进行评估，并将其与分光光度法进行对比，结果见表2。

表2 两种方法对血样中L-乳酸的检测（略）

Table 2 Determination results of L-lactate in real serum using two methods

对结果进行t校验： t＝0.09288； t0.05(11)= 1.7959； t＜t 0.05(11)， p＞0.05。

由以上结果可以看出，两种方法测定结果无显著差异。本传感器对样品的测定结果与分光光度法具有很好的一致性。