常染色体显性多囊肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断的实验研究

作者：朱琴，徐炳森，黄学锋，周颖

【摘要】 目的 ：建立由PKD1突变所致常染色体显性多囊肾疾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)的胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)方法。方法：①通过微卫星连锁分析确定2个多囊肾家系的ADPKD致病基因。检测的微卫星包括为与PKD1连锁的KG8、SM6、CW4和CW2以及与PKD2连锁的D4S1534、D4S1563、D4S414和D4S423。②对18个淋巴细胞和1个PKD1突变所致ADPKD成员行常规体外受精胚胎移植后的5个废弃胚胎15个卵裂球行多重巢式PCR和毛细管电泳检测与PKD1连锁的微卫星分型。结果：①KG8、CW4和CW2 可作为连锁微卫星分析外周血和单个细胞的PKD1突变;②2个家系的致病基因均为PKD1;③单个卵裂球扩增成功率为86.67%(13/15)，单个淋巴细胞扩增成功率为88.89%(16/18)，CW4等位基因脱扣率为25%(4/16)，CW2未发现等位基因脱扣，均未发现污染，2个胚胎携带致病基因。结论：PKD1连锁的微卫星分型可作为PKD1突变所致ADPKD的PGD诊断方法。

【关键词】 常染色体多囊肾疾病;PKD1;微卫星;植入前诊断;遗传学

Abstract: Objective: To establish a method of preimplantation genetic diagnosis (PGD) for autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) caused by PKD1 mutation. Method: PCR and capillary electrophoresis were used to analysis microsatellite markers KG8， SM6， CW4 and CW2 linked to PKD1 and D4S1534，D4S1563，D4S414 and D4S423 linked to PKD2 in two ADPKD families to find out the possible mutation of the 2 families. Then， microsatellite typing was performed using multiplex nested PCR and capillary electrophoresis in 5 embryos (15 blastomeres)， which were discarded after in vitro fertili-zation and embryo transfer in an ADPKD male caused by PKD1 mutation， and 18 lymphocytes from a normal donor. Result: Microsatellite markers KG8，CW4 and CW2 can be used for linkage analysis in peripheral blood and single cells. The linkage analyses confirmed that ADPKD in the two families were caused by PKD1 mutation. The PCR amplification success rates of single blastomeres and single lymphocytes were 88.89% (13/15) and 86.67% (16/18)， respectively. The allele drop-out (ADO) rate of CW4 was 25% (4/16)，while ADO did not occurred in CW2. Contamination rate was zero. Two embryos were mutation-affected. Conclusion: The linkage analysis using microsatellite markers can be used in PGD of ADPKD caused by PKD1 mutation.

Key words: ADPKD;PKD1;microsatellite;preimplantation diagnosis;genetic

常染色体显性多囊肾疾病(autosomal domi-nant polycystic kidney disease，ADPKD)是最常见的常染色体显性遗传的单基因遗传病，人群发病率为1/1 000[1]。ADPKD的主要表现为肾脏进行性囊性改变，常导致终末期肾病，居我国终末期肾病病因的第4位[2]。ADPKD具有延迟性发病的特点，其症前检查结果很少影响未生育患者的生育意向，使其成为最易遗传给下一代的严重遗传病之一。因此，对ADPKD患者进行胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis， PGD)，即可满足患者生育的愿望，又可避免生育患ADPKD的后代。目前认为ADPKD主要与PKD1和PKD2基因有关，其结构复杂，缺乏突变热点，因此难以通过直接检测突变行PGD诊断。本研究拟建立与PKD1基因紧密连锁的单个细胞微卫星分型的方法以进行ADPKD的PGD诊断。

1 对象和方法

1.1 对象 在不育门诊收集2个多囊肾家系，共16人，系谱图见图1。多囊肾的临床诊断主要依据超声检查结果。每个多囊肾家系成员取静脉血2 mL，用枸橼酸抗凝。家系A的A-II-1和A-II-2夫妇在本院行常规体外受精和胚胎移植，捐献了5个不适宜冷冻和移植的废弃D3胚胎，共获取卵裂球15个。18个单个淋巴细胞来自不育门诊的非多囊肾男性不育患者。上述取材均获得知情同意。

1.1.1 外周血DNA提取：用QIAGEN DNA提取试剂盒，按说明步骤提取DNA备用。

1.1.2 单个卵裂球的制备：废弃胚胎在pH为1.5的盐酸滴中去透明带，随后将胚胎转移至含5%人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HEPES)微滴中，用毛细管吹散卵裂球，每个卵裂球依次在3个含5% HSA的HEPES微滴中洗涤，并取最后1个微滴洗涤后液体为阴性对照。将卵裂球转入含5μL细胞裂解液(0.005μL的Tweeen20，0.005μL的TritonX-100，0.1μL的Proteinase K(20 mg/mL)，0.5μL的10×PCR buffer，4.39μL的双蒸水)的PCR管中，-20 ℃保存备用。

1.1.3 单个淋巴细胞的制备：先用percoll60分离出单个核细胞，然后在倒置显微镜下通过显微操作吸取单个淋巴细胞，分别在3滴PBS液中洗涤，同时取最后1个微滴洗涤后液体为阴性对照，将单个淋巴细胞转移至含5μL细胞裂解液的PCR管中，-20 ℃保存备用。

1.2 PCR反应

1.2.1 引物设计：卵裂球第一轮扩增外引物和SM6内引物用primer3软件设计。其他引物序列

1.2.2 单细胞第一轮扩增反应：9个卵裂球和18个淋巴细胞应用四重巢式PCR，其余6个卵裂球应用双重PCR，反应体系均为50μL，其中模板为含5μL细胞裂解液的单个卵裂球，10×PCR buffer4.5μL，dNTP3μL(10 mmol/L)，镁离子4.5μL(50 mmol/L)，KG8和CW2正反引物各加2μL(10 μmol/L)，SM6和CW4引物各加3μL(10 μmol/L)，Taq酶0.3μL，用水补充至50μL，其中12个淋巴细胞所用的酶为High Fidelity Taq酶。PCR程序：先灭活蛋白酶K，程序为：45 ℃，1 min，96 ℃，20 min。在72 ℃时将上述反应液加入到模板里，PCR程序为96 ℃，1 min;96 ℃，30 s，58 ℃，1 min 30 s，72 ℃，1 min，共25个循环，最后72 ℃再延伸10 min。另外6个卵裂球应用双重巢式PCR，反应体系也为50μL，模板5μL，10×PCR buffer4.5μL，dNTP3 μL(10 mmol/L)，镁离子3μL(50 mmol/L)，KG8和CW2正反引物各加2μL(10 μmol/L)，Taq酶0.26μL，用水补充至50μL，PCR程序同上。dNTP、镁离子、Taq酶和High Fi-delity Taq酶均购自invitrogen公司。

1.2.3 卵裂球第二轮扩增与外周血PCR扩增的反应：反应体系均为45μL，KG8反应体系为10×PCR buffer 4.5μL，10 mm的dNTP2.25μL，5 mmol/L镁离子6.3μL，10 μm的KG8正反引物各1.8μL，模板4.5μL，Taq酶0.315μL，最后用水补充至45 μL;循环条件96 ℃，4 min;96 ℃，45 s，58 ℃，45 s，72 ℃，30 s;共36个循环，后72 ℃，10 min。SM6、CW4、CW2、D4S1534、D4S1563、D4S414和D4S423镁离子浓度分别为0.9 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L、1.5 mmol/L和1.5 mmol/L;退火温度分别为55 ℃、60 ℃、55 ℃、55 ℃、62 ℃、62 ℃和62 ℃，其余条件都等同于KG8。

1.2.4 电泳：取10μL扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，出现预期条带的扩增产物进行毛细管电泳，做STR(short tandem repeats，STR)分型(由上海基康公司提供服务)。

2 结果

2.1 多囊肾家系的微卫星连锁分析 通过8个微卫星位点的分型结果，以染色体的最少交换原则创建单倍型，见图1，其中B-I-2的单体型是通过家系其他成员的微卫星分型和孟德尔遗传规律推测出的基因型。2个家系的致病基因均为PKD1，通过家系分析发现：A-II-1、A-II-3、A-II-4、A-II-6、A-III-1、B-II-3共6个SM6的STR(short tandem repeats)分型结果不能由亲代推导出，A-II-3的D4S1563同样也发生了类似的现象，其余6个微卫星位点均未出现异常结果。B-II-3来自于父亲的染色体在生殖细胞发生时发生了交换(D4S1563与D4S414之间)。A-III-1携带致病基因，但只有7岁，可能尚未发病。

2.2 单个淋巴细胞的微卫星分型结果 本实验18个单个淋巴细胞均做四重巢式PCR，4个位点中，CW2和CW4有多态性信息。在第一轮反应中，6个应用Taq酶，5个扩增成功，12个用high Fidelity Taq酶，11个扩增成功，扩增成功率为88.89%(16/18);在CW4位点有4个出现了等位基因脱扣(allele dropout，ADO)， CW4的ADO率为25%(4/16)，CW2基因未发现ADO。阴性对照均未出现阳性条带，污染率为0。有1个淋巴细胞(在第一轮反应用Taq酶)的CW2的分型结果为116/118，而其他15个淋巴细胞为118/120，提示116/118为错误分型。见图2。

2.3 胚胎的微卫星分型结果 5个废弃胚胎的15个卵裂球9个行四重巢式PCR，7个扩增成功，6个行双重巢式PCR，均扩增成功，扩增成功率为86.67%(13/15)，未发现污染。KG8出现3个ADO，而CW4与CW2未出现ADO。微卫星SM6结果均不能由亲代推导出，7号和10号卵裂球(胚胎d)，11号卵裂球(胚胎e)的CW2基因型结果不能由亲代推出。从KG8、CW4和CW2分型结果进行分析：胚胎a和d为携带致病基因胚胎，胚胎b、c和e为正常胚胎，其中，胚胎a的来自于父方的染色体在生殖细胞形成时发生了交换(CW4与CW2之间)，但是KG8位于基因内部，CW4和CW2位于基因外部，因此确定此胚胎携带有致病基因。胚胎c的来自父方的染色体在生殖细胞形成时发生了交换(在SM6与CW4之间，CW4与CW2之间)。胚胎d中卵裂球7和10和胚胎的卵裂11的CW2出现酶链滑移，卵裂球8、9和10e的KG8出现了ADO，但是与父亲致病基因PKD1连锁的KG8分型均出现在4个卵裂球中，故该胚胎也携带有致病基因。5个胚胎的STR分型见图3。卵裂球3(未携带致病基因)和卵裂球8(携带致病基因)的微卫星KG8、CW4和CW2的STR分型分别见图4。

3 讨论

PGD是一种通过选择遗传正常的种植前胚胎植入母体子宫从而避免出生遗传异常患儿的产前诊断方式。与常规产前诊断技术相比，PGD除了可以防止遗传病的发生之外，还可避免选择性流产和反复性流产造成的各种危害，正成为一个更易为人们所接受的产前诊断技术。目前PGD已经应用于200多种单基因遗传病，常用的胚胎遗传学诊断技术包括PCR后限制性酶切、杂合子分析、单链构象多态分析、变性凝胶电泳以及片段长度荧光PCR分析等[4]。

ADPKD主要与PKD1和PKD2基因有关，其致病基因庞大，结构复杂，有较多的重复序列，突变可能涉及整个基因，种类多并缺乏突变热点，这使对基因突变行常规直接检测较为困难。目前，ADPKD常用的遗传学诊断方法是采用对与致病基因紧密连锁的微卫星进行连锁分析[5]。微卫星分布广泛，具有高度多态性，在人群中表现出高度的个体特异性，与PKD1紧密连锁的KG8、SM6、CW4和CW2以及与PKD2连锁的D4S1534、D4S1563、D4S414和D4S423等微卫星在中国人群中是高度多态的[3]。KG8在PKD1基因内部，SM6、CW4、CW2位于PKD1基因外部的同一侧，CW2离PKD1最远，重组率为0.27%;D4S1534、D4S1563、D4S414和D4S423均在PKD2基因的外部，其中D4S1563、D4S414和D4S423在PKD2基因的同一侧，D4S1534在PKD2基因的另一侧，D4S423离PKD2最远，重组率为3.47%。本实验选用了这8个微卫星为遗传标记对2个家系进行连锁分析，找出致病基因后，应用与该致病基因连锁的有信息的微卫星位点为遗传标记筛选正常胚胎。

我们的结果表明，2个多囊肾家系的致病基因均为PDK1突变，除SM6外的KG8、CW4和CW2等微卫星可以作为PKD1的连锁微卫星遗传标志。SM6的异常结果与文献报道[6]的相似，原因可能为毛细管电泳的条件不够优化，鉴于其在不同的电泳条件下出现不同的结果，表明其可能不适合行PDK1的连锁分析，也不适合作为单个卵裂球的遗传标志。

近年来，应用多重PCR同时扩增多个微卫星位点为遗传标记，在脊髓小脑共济失调症[7]、脊髓性肌萎缩[8]、马凡氏综合征[9]、HLA配型[10]和ADPKD[5，11]等的植入前遗传学诊断中获得成功。采用多重PCR同时扩增多个微卫星位点行PGD具有以下优点：①通用性高，不需为不同突变的患者设计特异的分子遗传诊断检测技术，这对于致病基因大，突变种类多的遗传疾病(如常染色体隐性遗传囊性纤维化)或缺乏突变热点的遗传病(如ADPKD)尤为适用。我们采用的位于PKD1基因内KG8和基因外CW4和CW2在这两个多囊肾家系中具有多态信息，因此多重PCR可用于这两个家系患者和其他ADPKD患者的PGD诊断。增加微卫星位点可以增加通用性。②减少了PGD误诊率。等位基因脱扣(allele dropout，ADO)是导致PGD误诊的主要原因。对于常染色体显性遗传病，当等位基因中的突变基因扩增失败时可导致将患病胚胎误诊为正常胚胎。引起ADO的确切原因尚未知晓，Piyamongkol等[12]研究表明，ADO可能与扩增微卫星的长度、DNA降解数量、细胞的冻融、PCR程序、同时扩增的单细胞数量有关，即使在最有经验的PGD实验室的ADO率也达5%～15%。采用多重PCR是减少因ADO误诊的重要手段。Rechitsky等[13]在囊性纤维化(CF)的PGD诊断中发现，基因CFTR外显子10的ADO为33.3%，内含子6的1个连锁标志的ADO为20.4%，但两者同时出现ADO降至13.9%。我们的结果表明，二重或四重PCR中在同一个单细胞中，没有出现2～3个微卫星位点同时出现ADO的情况。胚胎d的KG8位点发生ADO，但另外的位点获得正确扩增，仍可使其获得正确的诊断，这可大大减少PGD误诊率。此外，多重PCR同时扩增多个微卫星位点可以避免由于基因重组引起的误诊，胚胎a和c出现的基因重组现象也获得正确诊断。

在DNA复制过程中的滑链错配(strand slippage)机制导致了微卫星STR分型错误。本研究中的卵裂球7、10和11及1个淋巴细胞的CW2基因出现了错误分型，但是在第一轮PCR应用高保真酶的单细胞中未发现此类现象。故考虑分型错误可能是由于在DNA复制时发生了链滑脱现象，并且其荧光信号强于目的基因。其原因可能为：①与STR位点有关，微卫星滑脱率与微卫星长度有关[14];②起始模板量太少，可能有部分DNA降解，普通Taq DNA酶不具备3’-5’外切酶活性，对发生错误合成的DNA序列不能校正，在第一轮反应中即出现了错配，但未及时校正，故在第二轮反应中出现了错上加错的现象。

本实验应用的单细胞多重巢式PCR，扩增单个卵裂球成功率为86.67%，而Rycke等[5]单卵裂球扩增成功率为96.1%，分析原因可能为：本研究所用的胚胎均是不适宜移植和冷冻的胚胎，质量较差，可能有核变性降解或无核现象等。挑选细胞核清晰的卵裂球进行PGD可以提高扩增成功率。

总之，本实验应用多重巢式荧光PCR及毛细管电泳微卫星STR分型进行PGD的初步研究，扩增成功率高，ADO低，同时扩增两个及以上微卫星位点能减少因为ADO和基因重组而导致的误诊，可作为ADPKD植入前遗传学诊断的方法，但仍需改进微卫星检测中滑链错配现象以减少由此导致的STR分型错误。