含中药龙血竭的血清处理方法分析

作者：周晔，金描真，易军，曾伟坚

【摘要】 目的 研究含中药龙血竭的血清处理方法。方法采用适宜蛋白沉淀剂并以有机溶剂提取处理含中药龙血竭的血清样品，测定含药血清的HPLC图谱，以龙血竭溶液中5个特征成分的峰面积为对照计算提取率，确定制备含药血清的最佳方法。结果通过乙腈沉淀蛋白，采用乙酸乙酯进行提取，可使含药血清中龙血竭特征成分的提取率达到80%以上。结论本法可作为龙血竭含药血清的制备方法。 【关键词】 龙血竭；含药血清；蛋白沉淀 Abstract:Objective To establish a method for the treatment of serum of rabbits fed with Dracaena.Methods Various protein precipitators and organic solvents were used to process the serum samples. HPLC was used to determine the target subjects. Five chemicals and their characteristic peaks were used to evaluate the treatment process of the serum.Results The average recovery of Dracaena’s major components reached 80% after precipitated by acetonitrile first and then extracted by ethyl acetate.Conclusion The method provides a reliable approach to prepare the serum containing Dracaena. Key words:Dracaena cochinchinesis(Lour.)S.C.Chen； herb serum；protein precipitation 龙血竭为传统中药，是龙舌兰科植物剑叶龙血树［Dracaena cochinchinensis(Lour)S.C.Chen］含树脂木材的乙醇提取物［1］。龙血竭总黄酮（sanguis draconis flavones，SDF）是从龙血竭中提取得到的主要成分［2］，包括黄酮、二氢黄酮、黄烷、查耳酮、二氢查耳酮等20多种化合物［3］。动物实验表明，龙血竭总黄酮能对抗整体动物心肌缺血损伤［2］。本实验将龙血竭HPLC图谱中特征峰较明显的5个成分的峰面积作为检测指标（其中2个主要成分为龙血素A和龙血素B），以龙血竭原溶液为对照计算体外加样后提取百分率，进行血清处理方法的研究。 1仪器与试剂 Waters高效液相色谱仪：515 HPLC泵，2487双波长吸收监测器，N2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；TDL802B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；超声仪（上海超声波仪器厂）；TU1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ZH2 BLENDER涡旋混合器（天津药典标准仪器厂）。 广西产龙血竭（广西中医学院制药厂提供）；龙血素A、龙血素B对照品（中国药品生物制品检定所提供）；乙腈（色谱纯）；甲醇，乙酸乙酯，丙酮，正丁醇，乙醚，三氯甲烷，正戊醇，95%乙醇，无水乙醇，三氯醋酸，均为分析纯；新西兰大耳白兔（广东省医学实验动物中心提供）。 2HPLC法的建立 2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；保护柱：Easyguard C18 Replacement Cartridges Cat#6101；流动相：乙腈1%冰醋酸（体积比38∶62）；检测波长：280 nm；流速：1.2 mL/min。 2.2溶液的制备 取龙血素A、龙血素B对照品适量，用甲醇分别配制成每1 mL含10 μg的溶液，作为对照品溶液。 取广西龙血竭，用甲醇配制成每1 mL含2 mg的溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液。 2.3线性范围 将龙血素A对照品溶液分别配制成浓度为0.925、4.625、9.250、13.875、18.500、23.125 μg/mL的溶液，进样10 μL，记录色谱图，进样量（m）与峰面积（A）的回归方程为：A=45 064 451m-10 379 768，r=0.999 2，线性范围为9.25～231.25 ng。 同上，将龙血素B对照品溶液分别配制成浓度为0.947、4.735、9.470、14.205、18.940、23.675 μg/mL的溶液，进样10 μL，记录色谱图，进样量（m）与峰面积（A）的回归方程为：A=33 227 615m-10 135 858，r=0.999 0，线性范围为9.47～236.75 ng。 2.4稳定性试验 取“2.2”项下的供试品溶液分别于0、2、4、6、8、24 h进行检测，分别记录5个特征性成分的峰面积，相应峰面积的RSD值分别为1.83%、3.09%、2.89%、2.47%、2.05%，即供试品溶液在24 h内保持稳定。 2.5供试品溶液HPLC图谱 取“2.2”项下的供试品溶液，龙血素A、龙血素B对照品溶液及空白血清样品，各进样10 μL，记录HPLC图谱，见图1。 图1供试品溶液（A）、龙血素A对照品(B)、龙血素B对照品(C)及空白血(D)HPLC图谱略 含中药龙血竭的血清处理方法研究在供试品溶液图谱上选取5个特征峰较明显的成分作为检测指标，保留时间分别为10.232、15.498、26.665、35.732、38.732 min，其中峰4和峰5经验证，确定为龙血素A(4′羟基2，4二甲氧基二氢查耳酮)和龙血素B（4′羟基2，4，6三甲氧基二氢查耳酮）［4］，峰1、2和3结构未知。由上图可知，空白血清样品无干扰。 3结果与讨论 3.1提取率的计算 特征性成分的提取率=血清样品中特征性成分的峰面积/供试品溶液相应成分的峰面积×100%

［2］ 方伟蓉，李运曼，邓嘉元.龙血竭总黄酮对动物心肌缺血的保护作用［J］.中国临床药理学与治疗学，2005，10（9）：1020-1024.

［3］ 张庆云，朱辉.龙血竭研究进展［J］.武警医学院学报，2004，13（1）：69-71.

［4］ 周志宏，王锦尧.龙血竭的化学成分研究［J］.中草药，2001，32：484-486.