中药益发复方对人头皮毛囊体外培养的分析

作者：陈达灿 刘维 陈修漾 孙静 周丹 韩凌

【关键词】 中药益发

摘要: 【目的】观察中药益发复方对人头皮毛囊体外培养的影响。【方法】健康志愿者1名，采血制备空白血清后，给予18.33g/kg剂量的益发复方口服，连续7d，于第8天清晨空腹服药后采血制备含药血清;复制人头皮游离毛囊体外培养模型，分为7组:空白对照组加Williams E无血清培养基，空白血清组分别加入体积分数为5%、10%、20%血清，益发复方含药血清组分别加入体积分数为5%、10%、20%的中药含药血清;采用倒置显微镜观察毛囊大体形态变化，并测量毛囊生长长度和生长时间，计算前4d平均生长速度和最终生长长度。【结果】不同剂量空白血清组前4d平均生长速度、生长时间、最终生长长度均减少，与空白对照组比较具有显著性差异（均P<0.05或P<0.01）;不同剂量中药含药血清均可不同程度升高以上指标（P<0.05或P<0.01），其中以体积分数为10%中药含药血清的作用更为显著。【结论】益发复方具有促进毛囊生长、维持毛囊正常形态的作用，而空白血清对毛囊生长具有一定的负影响。

关键词: 秃发/中药疗法; 益发复方/药物作用; 器官培养; 人

中药益发复方来源于我院皮肤科名老中医的经验方，是根据中医理论并结合多年的临床实践经验和现代药理学研究研制开发而成的内服生发制剂，在近年来治疗脱发病的临床应用中已取得较好的疗效 ［1-2］ 。为从细胞生物学角度初步探讨其作用机理，我们通过在体外建立毛囊器官培养模型，观察了该方对游离人发毛囊生长情况的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源 20～40岁脑外科病人手术过程中废弃的正常全层头皮（无秃发、感染等异常）。

1.2 试剂与仪器 毛囊培养基由Williams E无血清培养基（Gibco BRL公司），L-谷氨酰胺（Amresco公司）2mmol/L，Hepes20mmol/L、牛胰岛素10μg/mL、转铁蛋白10μg/mL（Sigma公司），氢化可的松（扬州制药厂）0.4μg/mL，青霉素、链霉素（华北制药股份有限公司）100U/mL组成。手术显微镜（YZ20P5，苏州六六视觉科技有限公司）;倒置显微镜（Nikon T300带目镜测微尺，日本尼康公司）;CO 2 培养箱（HSO301T-VBA，美国Harris公司）;电热恒温水浴箱（HH・W21・600，上海跃进医疗器械厂）;净化工作台（SW-CT-IF，苏 州净化设备厂）。

1.3 血清的制备

1.3.1 空白血清的制备 健康志愿者1名，清晨空腹时肘部浅静脉采血，取血于无抗凝试管中，常温静置一段时间后，在离心机内分离血清，取上清液，经56℃、30min灭活处理后，用针头滤器滤过除菌，-20℃以下保存备用。

1.3.2 中药含药血清的制备 ［3-4］ 益发复方由女贞子20g、菟丝子20g、黄芪15g、制首乌15g、蒲公英15g、丹参15g、甘草10g组成，生药由广东省中医院中药房提供。上述中药加水1000mL，浸泡30min，煮沸后文火煎至200mL，倒出药液;加水400mL复煎，煮沸后文火煎至100mL，合并两次药液，给同一健康志愿者服用（18.33g/kg），每次1剂，每天2次，连续给药7d，于第8天清晨空腹服药（服药前应禁食12h）后1h采血，血清制备方法同1.3.1。

1.4 游离毛囊的分离与培养 ［5-6］ 从手术室取回新鲜全层头皮标本，用生理盐水漂洗血污，并剪除外露的毛干及部分过多的脂肪组织（注意勿伤及毛球），再用D-Hanks液（含青霉素400U/mL、链霉素400U/mL）连续冲洗3遍，每遍3～5min;将头皮标本剪成0.3～0.5cm宽的皮条，用眼科手术剪从真皮与皮下组织交界处剪开，弃真皮和表皮部分。在解剖显微镜下（×8）用显微外科镊夹紧毛根远端，顺毛囊方向轻轻从皮下组织中拔出完整的毛囊，置于无菌培养液中待养。在倒置显微镜下选取结构完整的生长早期毛囊（即外毛根鞘完整、毛乳头形态圆润光滑，第1天即有明显生长，生长长度l≥0.1mm的毛囊），在超净台内将其小心转移至24孔板内，每孔1根毛囊，再加入毛囊培养基0.5mL，加盖，置于37℃、含体积分数为5%CO 2 及一定湿度的培养箱中进行培养，每隔4d换培养液1次，每次换液50%左右。

1.5 实验分组 共分为7组，第1组以不加任何中西药的Williams E无血清培养基作为空白对照组;第2～4组为分别加入不同容积培养基稀释后体积分数为5%、10%、20%的空白血清组;第5～7组为分别加入不同容积培养基稀释后体积分数为5%、10%、20%的中药含药血清组。

1.6 观测指标

1.6.1 毛囊形态观察 在倒置显微镜下连续观察每日各组毛囊毛球部及其内部结构（包括毛母质、毛乳头以及内、外毛根鞘）的形态变化，记录其变化特点，并分别照相。

1.6.2 毛囊的生长速度及其生长时间的测定 在装有目镜测微尺的倒置显微镜下，测量每24h各组毛囊从毛根基部至毛干游离顶端的长度，直至毛囊不再延长。记录毛囊的生长长度和生长天数，并计算出前4d的平均生长速度和最终生长长度。

1.7 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件对实验数据进行统计处理，各组间的比较采用成组t检验和方差分析。

2 结果

2.1 毛囊大体形态变化 倒置显微镜下动态观察显示，各组毛囊逐日延长，表现为毛干和内、外根鞘的共同生长，结缔组织鞘未见延长。毛囊快速生长主要集中在前4d，此时各组毛囊总的形态没有明显变化，毛囊各层结构清晰，毛球部饱满，毛乳头与毛母质界线分明且呈锥形嵌入其内。生长初、中期，毛干与内、外根鞘的增长长度基本相等;到末期，毛干的生长速度稍快，最后毛干稍突出于毛根鞘外。随着培养时间的延长，部分毛囊开始贴壁生长，生长速度明显减慢。贴壁后的毛囊稍有延长或长度基本无变化，其形态结构开始发生改变，表现为毛囊各层次稍显模糊，毛球部逐渐增大变圆，毛囊基部与毛母质之间的距离缩短，毛囊中段变粗。毛囊停止生长后开始出现退行期样改变，毛球部形态变得极不规则，毛囊下段轻度弯曲，毛根呈棒状;随后毛母质逐渐上移，与毛乳头距离拉长，直至完全分离。空白对照组的毛囊在培养的第1周形态完好，层次清晰;部分毛囊在第8天开始贴壁，1～2d后毛囊停止生长，呈早期退行变化。空白血清组的毛囊平均贴壁生长时间为5d，第6天大部分毛囊形态开始发生改变，随即迅速进入退行期。中药含药血清组的毛囊平均贴壁生长时间为6～7d，8d后逐渐进入退行期。结果见图1。

2.2 各组毛囊的生长情况 结果见表1。毛囊在Williams E培养基（即无血清空白对照组）中生长良好，毛囊持续生长最长可达11d，最终平均生长长度为（1.25±0.26）mm，培养过程中未发现污染情况。各组毛囊在培养前4d生长速度较快，其中前2天长得最快，以后逐渐减慢。10%和20%中药含药血清组前4d的平均生长速度和最终生长长度均优于相应的空白血清组（P<0.05或P<0.01）。各组毛囊生长时间比较，10%和20%中药含药血清组的可生长天数均长于相应的空白血清组（P<0.05），但较空白对照组缩短。据图2～3所示，中药含药血清组中，10%含药血清组的平均生长速度和最终生长长度均优于其他两组。由图3可见，随着血清加入量的增多，空白血清组中毛囊总生长长度均逐渐递减。

3 讨论

毛囊是一个由内毛根鞘、外毛根鞘、结缔组织鞘（又称真皮鞘、纤维根鞘）、毛乳头、黑色素细胞等构成的皮肤附属器官，毛发的生长和毛囊的周期性再生依赖于毛囊上皮和真皮间的信息传递来实现，毛发延长主要是由于毛母质细胞分裂增生的结果。Philpott等 ［5］ 在1990年首先建立了人头皮游离毛囊的生长模型，我国从1996年始也逐渐建立了游离毛囊体外培养（小鼠触须、人头皮毛囊和猪耳毛囊）的方法，并就一些细胞因子、皮质类固醇及药物对毛囊生长的影响进行了探讨 ［7-10］ 。 目前关于中药对毛囊体外培养的实验研究主要为单味中药及其提取物（单体）对小鼠触须毛囊生长的影响，作用方式为药物成分加入培养基中在体外与游离毛囊直接作用，其结果尚不足以说明中药在人体内的药理效应。我们参照中药血清药理学的实验方法，采用含中药成分的人血清掺入毛囊培养，克服了中药粗制剂中非有效成分和本身的理化性质对实验结果的干扰，其实验条件更接近药物在体内环境中产生药理效应的真实过程，在一定程度上更能反映整体给药的效果 ［11-12］ 。中药益发复方中女贞子、菟丝子平补肝肾，为君药，《本草备要》认为女贞子能“补肝肾，安五脏，强腰膝，明耳目，乌须发”。黄芪补气固表，紧束发根;何首乌补肝肾、益精血、乌须发，《本草纲目》谓之“…能养血益肝，固精益肾，健筋骨，乌髭发，为滋补 表1 各组毛囊生长情况的比较良药”，二者共为臣药。蒲公英清热利湿，《本草纲目》谓之有“乌须发，壮筋骨”之效;丹参清热凉血、活血启窍，二药可防本方过于温燥，反伤阴血之虞，用为佐药。甘草补脾益气、调和诸药，为使药。诸药合用，共奏补益肝肾、益气活血、清热祛湿、启窍生发之功效。

本研究使用Williams E培养基成功地采用游离毛囊体外培养技术，对人头皮毛囊的生长情况进行了观察。在实验中我们发现，在含有血清的培养基中毛囊虽能保持一定的增长速度，但与无血清空白对照组相比其生长速度相对较低，生长时间有所缩短，贴壁时间提早，因而毛囊总生长长度也相应减小。说明血清中的某些成分可诱导毛囊进入退行期，对毛囊的生长具有一定的负影响 ［13］ ，此过程是否类似于自然新陈代谢的退行性变化过程，有待进一步证实。为了排除这种干扰，我们设立了与中药含药血清组相对应的3个空白血清组，以确保实验的可比性。通过毛囊在不同条件下各项生长指标的观察，结果显示10%和20%中药含药血清组毛囊的生长速度、生长时间和最终生长长度均优于相应的空白血清组（P<0.05），其中以10%中药含药血清的作用最为显著（P<0.01）。此外我们发现，在体积分数为5%～20%的范围内，随着中药含药血清加入量的逐渐增加，其药理效应曲线并非相应地呈现递增趋势。分析原因可能是由于血清本身含有抑制毛囊生长、促使毛囊贴壁的成分，如转化生长因子（TGF-β）、表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、粘附因子等。其中TGF-β可抑制毛囊上皮增殖，促使其提前进入退行期 ［14］ ;EGF则促进毛母质细胞向外根鞘细胞分化，诱导毛囊停止生长 ［15］ ，因此，可在一定程度上对抗含药血清中药物成分的药理效应。在5%中药含药血清组中，反应体系中的血药浓度尚低，故促进毛囊生长的作用尚不明显;而10%中药含药血清组血药浓度较高，血清的对抗作用较弱，因此该组的作用最为显著;20%中药含药血清组血药浓度虽高，但由于同时增加了血清的体积，使血清的对抗作用大大加强，所以对毛囊的促生长作用却低于10%中药含药血清组，其确切机制有待进一步证实。

本研究结果表明中药益发复方能够促进毛囊生 长、维持毛囊正常形态，从而达到减少毛发脱落、促进毛发生长的效果，这可能是该方治疗脱发的作用机制之一，但关于中药的作用方式和靶点仍是一大难题，有待于今后进一步探讨研究。当然，本研究是以含药血清对毛囊进行体外培养，而当中药内服时，其药物作用于毛发的途经和结果是否与本结果一致，有待进一步研究。

参考文献:

［1］陈达灿，胡东流，国维.中药益发治疗脂溢性脱发576例的近期疗效观察［J］.新中医，1996，28（8）:49.

［2］国维，陈达灿，胡东流.中药“益发”治疗脂溢性脱发的临 床与实验研究［J］.实用医学杂志，1997，13（4）:265.

［3］李仪奎.中药血清药理学实验方法的若干问题［J］.中药新药与临床药理，1999，10（2）:96.

［4］李振光，王净净.关于中药血清药理学方法的思考［J］.中国 中医药信息杂志，2002，9（2）:5.

［5］ Philpott M P，Green M R，Kealey T.Human hair growth in vitro［J］.J Cell Sci，1990，97（Pt3）:463.

［6］薛庆善.体外培养的原理与技术［M］.北京:科学出版社，2003:304.

［7］伍津津，刘荣卿，叶庆俏，等.人头皮游离毛囊培养［J］.中华皮肤科杂志，1996，29（4）:246.

［8］范卫新，朱文元，雷铁池.小鼠触须毛囊体外培养的研究［J］.中华皮肤科杂志，1999，32（1）:28.

［9］范卫新，Lars Mecklenburg，Ralf Paus.毛发研究的新模型―――猪毛囊体外培养的研究［J］.临床皮肤科杂志，2002，31（11）:677.

［10］范卫新，Mecklenburg L，朱文元，等.环孢素对毛囊细胞凋亡和部分生长因子mRNA表达的影响［J］.临床皮肤科杂志，2003，32（8）:435.

［11］曹俊，张红梅，王旋.中药血清药理学研究概况［J］.中国中医药信息杂志，2002，9（1）:80.

［12］张良，徐立，袁冬萍，等.中药血清药理学方法的研究进展［J］.南京中医药大学学报（自然科学版），2002，18（4）:254.

［13］唐建兵，陈璧，汤朝武，等.不同条件对人游离毛囊培养的影响［J］.西北国防医学杂志，2001，22（1）:57.

［14］ Soma T，Ogo M，Suzuki J，et al.Analysis of apoptotic cell death inhuman hair follicles in vivo and in vitro ［J］.J Invest Dermatol，1998，111（6）:948.

［15］ Bond J J，Wynn P C，Moore G P，et al.Effects of epidermal growth factor and transforming growth factor alpha on the function of wool follicles in culture［J］.Arch Dermatol Res，1996，288（7）:373.