大口静灰球生药学研究

作者：翁丽丽，齐放，宋启印，王淑敏

【摘要】 目的对大口静灰球进行生药学研究，建立其质量控制标准。 方法采用性状鉴别、显微鉴别的方法;利用高效液相色谱法测定麦角甾醇含量，对大口静灰球进行生药学初步研究。结果建立了大口静灰球的性状、显微鉴别方法，制定了麦角甾醇的含量测定方法与指标，其样品平均加样回收率为100.48%，RSD为1.26%。结论此实验建立的大口静灰球的性状鉴别、显微鉴别及含量测定方法操作简便，专属性强，可用于大口静灰球的质量控制。

【关键词】 大口静灰球; 生药学; 含量测定

马勃为常用中药，具有消肿、止血、解毒等功效，用于咽喉肿痛及各种出血[1] 。《中国药典》(2005年版)规定大马勃Calvatia gigantea (Batsch ex Pers.)Lloyd.，紫色马勃Calvatia lilacina (Mont. et Berk.) Lloyd和脱皮马勃Lasiosphaera fenzlii Reich.为中药马勃的来源。全国很多地区也用大口静灰球 Bovistella sinensis Lloyd.子实体作马勃入药。大口静灰球菌别名叫中国静灰球，来源于马勃科静灰球菌属。分布地区主要是河北、河南、山东、吉林、江苏、广东、陕西、甘肃、西藏和贵州等。有止血、解毒、清肺、消肿、利喉等作用，可治疗咳嗽、咽喉肿痛、扁桃体炎、外伤出血。含亮氨酸 、酪氨酸、尿素、麦角甾醇、类脂质、马勃素及磷酸钠等。本实验对大口静灰球进行生药学研究。

1 材料与仪器

1.1 药材 试验用大口静灰球干燥子实体Bovistella sinensis Lloyd 购于吉林省仙草药材公司，麦角甾醇对照品购自中国药品生物制品检定所。

1.2 药品和试剂乙醇、石油醚、水合氯醛(分析纯)、甲醇(色谱纯)、纯净水、蒸馏水。

1.3 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪(广州北锐精密仪器有限公司);METTLE TOLEDO型电子天平(瑞士梅特勒-托立多公司);XS-213型生物显微镜。

2 方法与结果

2.1 大口静灰球性状鉴别子实体陀螺形至近球形，直径6～12cm。不孕基部小，外包被浅青褐色至浅烟色，薄，粉粒状，易脱落。内包被膜质，柔软，浅灰绿色，具光泽，成熟后上部不规则开裂成大口。孢体浅烟色。海绵状，具弹性[2] (图1)。图1 大口静灰球

2.2 大口静灰球的显微鉴别

2.2.1 大口静灰球临时装片的制备将适量大口静灰球研碎成粉末，取极少量粉末涂于载玻片上，滴加2滴水合氯醛，轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡，制成临时装片。

2.2.2 大口静灰球的显微鉴别[3~5] 将大口静灰球粉末临时装片置于显微镜下，观察，找出大口静灰球粉末的典型特征。

2.2.3 实验结果孢子球形，黄褐色 ，光滑或具不明显小疣，直径4.5～5.5 μm。具无色透明小柄，长5～12.5 μm。孢丝褐色，稍有分枝，直径2.5～6 μm。见图2~3。图2 孢子(10×40) 图3 孢丝(10×40)

2.3 高效液相色谱法测定大口静灰球子实体中麦角甾醇含量

2.3.1 对照品溶液的制备精密称取麦角甾醇对照品5 mg，置于5 ml量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备麦角甾醇样品的制备：精称大口静灰球子实体4 g，石油醚(60～90℃)索氏提取6 h，提取物水浴蒸干，乙醇溶解并定容至10 ml，即得样品液。

2.3.3 色谱条件色谱柱为Diamond OSD(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇;检测波长282 nm;柱温25℃;理论塔板数按麦角甾醇计不低于3 000。

2.3.4 方法学考察

标准曲线的绘制：精密称取麦角甾醇对照品适量，加流动相制成1 mg/ml的对照品溶液，即得。进样量分别为9，12，15，18，21 μl，注入液相色谱仪，以相应含量为横坐标，峰面积为纵坐标，峰面积分别为9 710.56，13 047，16 370.9，19 749.4，23 081.5，进行线性回归，得回归方程为Y=1 114.8X-330.27，r=1，表明其在9～21 μg线性范围良好精密度实验：精密称取麦角甾醇对照品，加甲醇制成1 mg/ml的对照品溶液，精密吸取对照品溶液15 μl，注入高效液相色谱仪，重复5次，记录峰面积积分值分别16 975，16 472，16 157，16 446，16 429，结果RSD 1.80%，结果表明精密度良好。稳定性实验：取提取的同一样品，依照供试品溶液制备方法，于0，2，4，8，12，24，48，72 h，分别测定峰面积，记录峰面积积分值分别为17 629，17 390，17 748，17 428，17 526，17 236，17 632，17 895。实验结果表明，样品溶液在72 h内测定，色谱峰无明显变化，RSD1.20%，表明样品在72 h内稳定重复性实验：取提取的同一样品溶液5份，平行操作，测定麦角甾醇的含量，峰面积分别为20 832，20 856，20 863，20 888，20 902，计算其RSD为0.13%。表明实验重复性良好。回收率实验：精密称取已知含量的样品，分别精密加入麦角甾醇对照品7.0 μg，按供试品溶液的制备方法及上述高效液相色谱条件操作，测定其含量，计算回收率。结果见表1表1 大口静灰球中麦角甾醇加样回收率实验结果样品中含量m/μg麦角甾醇m/μg测得值m/μg回收率(%)平均值(%)2.3.5 含量测定取大口静灰球子实体，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样测定，计算大口静灰球提取液中麦角甾醇的含量，结果分别为1.713，1.721，1.709 mg/g，平均值为1.714 mg/g(见图4)。麦角甾醇在9～21 μg范围内呈良好的线性关系，加样平均回收率为100.48%，RSD为1.26%。方法稳定可靠，准确性高，操作简单。A.对照品; B.样品

图4 大口静灰球HPLC图

3 小结

通过大口静灰球粉末显微鉴别，发现其孢子的特征可作为区别于其他马勃类药材(例如大马勃、脱皮马勃、紫色马勃等)的主要鉴别依据，为临床合理用药提供依据。

采用高效液相色谱法测定大口静灰球中子实体中麦角甾醇含量，在流动相为甲醇，检测波长为282 nm，柱温为25℃，理论塔板数按麦角甾醇计不低于3 000的条件下，麦角甾醇在9～21 μg范围内呈良好的线性关系，加样平均回收率为100.48%，RSD为1.26%。方法稳定可靠，准确性高，操作简单，可应用于大口静灰球的质量控制，为马勃进一步的研究提供了参考[6]。