瘰疬清胶囊药效学研究

作者：罗宇慧 彭蕴茹 叶其正 王志刚 石磊 沈明勤

【摘要】 目的观察瘰疬清胶囊对动物的止咳、抗炎及提高机体免疫力的作用。方法①小鼠灌胃瘰疬清胶囊16.0，8.0和4.0 g生药/kg后，采用浓氨水喷雾法进行止咳实验，观察动物咳嗽潜伏期及咳嗽次数。②大鼠灌胃瘰疬清胶囊8.0，4.0和2.0 g生药/kg的后，采用大鼠慢性炎症琼脂肉芽肿法，观察肉芽肿湿重及抑制率的变化，采用角叉菜胶致大鼠足肿胀法，测定大鼠足肿胀度及足肿胀抑制率。③注射环磷酰胺（CY）造成小鼠免疫功能低下模型，观察灌胃瘰疬清胶囊16.0，8.0和4.0 g生药/kg后，小鼠免疫功能的改变。结果瘰疬清胶囊能明显延长小鼠咳嗽潜伏期和减少咳嗽次数，对大鼠慢性炎症琼脂肉芽肿具有一定的抑制作用，对角叉菜胶致大鼠足肿胀具有一定的抑制作用，瘰疬清胶囊能明显对抗CY作用，提高免疫抑制小鼠的免疫功能。结论瘰疬清胶囊对实验动物具有一定的止咳、抗炎及提高机体免疫力的作用。

【关键词】 瘰疬清胶囊； 动物； 止咳； 抗炎； 免疫功能

瘰疬清胶囊由生牡蛎、夏枯草、七叶一枝花、玄参等组成，临床上主要用于治疗瘰疬，颈部淋巴结核。本实验主要观察瘰疬清胶囊对动物的止咳、抗炎及提高机体免疫力的作用，为临床应用提供实验依据。

1 器材

1.1 动物清洁级KM小鼠：♀♂兼有，体重18～22 g；清洁级SD大鼠：♂，体重280～360 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2002-0010号。

1.2 试药瘰疬清胶囊（干粉）：含6.88 g生药/g，批号20030718，江苏省中医药研究院中药制剂研究室提供。枸橼酸喷托维林片（咳必清）：每片含枸橼酸喷托维林25 mg，批号020118-2，苏州医药集团有限公司生产。浓氨水：分析纯，批号981125，益林化工厂生产。乙酰水杨酸肠溶片(阿司匹林)：25 mg/片，批号20020404，南京第二制药厂生产，使用时以蒸馏水配成浓度为10 mg/ml的药液供灌胃给药。琼脂：批号980424，中国药品生物制品检定所。角叉菜胶(TypeⅠ)：批号232-524-2，美国SIGMA公司生产。环磷酰胺粉针(CY)：200 mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号2003041521。盐酸左旋咪唑片：25 mg/片，南京第二制药厂，批号20010104。5%鸡红细胞悬液的制备：由市售肉鸡采血约10 ml，以肝素生理盐水抗凝，再按1∶1加入注射用0.9% NaCl液(NS)，充分混匀洗涤后，3 000 r/min离心15 min，弃去上清液，余下的红细胞再洗涤2～3次。取洗净离心后的红细胞4 ml，用NS液配制成5%浓度，现配现用。

1.3 仪器S-888型超声波雾化器，中外合资道芬电子有限公司生产；PB303-N千分之一电子天平 上海产；隔水式电热水浴箱；BH-2OLYMPUS显微镜：日本进口。

2 方法

2.1 小鼠止咳实验［1～4］取小鼠50只，称重，随机分为5组，每组10只，♀♂各半，分别为模型对照组（蒸馏水20 ml/kg）、阳性药咳必清对照组(0.05 g/kg)和瘰疬清胶囊大、中、小剂量组(16.0，8.0和4.0 g生药/kg)。各组动物灌胃(ig)给药，给药量均为20 ml/kg，给药1 h后各动物分别置于喷雾箱内，用超声波雾化器以相同强度将浓氨水雾化后喷入活动箱内，喷雾1 5 s后，立即观察动物咳嗽潜伏期（在吸入氨水气雾后至发生咳嗽所需时间为潜伏期），并记录2 min内的咳嗽次数，各给药组与模型对照组进行组间t－检验统计学处理。

2.2 大鼠肉芽肿实验［1～4］肉芽肿模型：大鼠背部中线处取2.0 cm×2.0 cm面积脱毛，消毒，皮下注射2%琼脂(56℃水浴保温)2 ml，注射后立即凸起球状包块即成。隔日取50只肉芽肿模型大鼠，全♂，随机分5组，每组10只，分别为模型对照组(蒸馏水10 ml/kg)、阳性药阿司匹林组(0.1 g/kg)、瘰疬清胶囊大、中、小3个剂量组 (8.0，4.0和2.0 g生药/kg)。各组动物ig给药，给药量均为10 ml/kg。ig 1次/d，连续给药7 d，每日观察肉芽肿变化，末次药后1 h脱椎处死大鼠，剪开肉芽部位皮肤，剥离肉芽肿琼脂块，称取湿重，各给药组与模型对照组进行组间t－检验统计处理。肉芽肿抑制率(%)按下列公式计算： 抑制率（%） =模型对照组均值 - 给药组均值模型对照组均值 ×100%

2.3 大鼠足肿胀实验 ［1～4］取大鼠50只，称重，随机分为5组，每组10只，全♂，分别为模型对照组（蒸馏水10 ml/kg）、阿司匹林组（0.1 g/kg）、瘰疬清胶囊大、中、小3个剂量组(8.0，4.0和2.0 g生药/kg)。给药量均为10 ml/kg。用足跖测定器测量每只大鼠左后肢正常足跖容积（10 ml注射器，上口刻有标记，内含中性洗涤剂的水溶液，通过硬塑料管连接另一5 ml注射器），用记号笔在大鼠左后肢踝关节周围做一标记，将大鼠左后肢浸入容器，使注射器上口标记与大鼠后肢关节标记和液面重叠，多余液体则抽入5 ml注射器内，抽入注射器内的液体量即为足跖容积。测量完给药前的正常足跖容积后，各组动物ig给药，30 min后，于左后肢足跖皮下注入1%角叉菜胶0.1 ml，注射0.5 h后（给药后1 h）按上述方法测量0.5，1，2，4，6，8 h的足跖容积，记录结果，并分别按下式计算肿胀率（%）和抑制率（%）。各给药组与模型对照组进行t－检验统计处理。 肿胀率（%）=致炎后足跖容积－致炎前足跖容积 致炎前足跖容积×100% 抑制率（%） =对照组平均肿胀度 - 给药组平均肿胀度对照组平均肿胀度×100%

2.4 小鼠免疫实验

2.4.1 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬实验取小鼠60只，随机分为6组，每组10只， ♀♂各半。分别为正常组和环磷酰胺（CY）模型组(蒸馏水20 ml/kg)、阳性药左旋咪唑组(25 mg/kg)、瘰疬清胶囊大、中、小剂量组(16.0，8.0和4.0 g生药/kg)。各组动物灌胃(ig)给药，给药量均为20 ml/kg，ig 1次/d，连续给药7 d，第5天除正常对照组外，每组动物腹腔注射CY 40 mg/kg (0.1 ml/10 g)，第6天各重复注射1次，末次给药后1 h小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.5 ml/只。再经2 h后脱颈椎处死动物，酒精消毒腹部，腹腔注射生理盐水2 ml，轻揉腹部，剪开皮肤，暴露腹膜，剪一小口用消毒吸管吸取腹腔细胞悬液0.2 ml，涂敷于玻片上，然后将玻片平放于潮湿的培养皿内在37℃的孵育箱内孵育30 min。再用NS冲洗去未粘附的细胞，待自然晾干后，甲醇固定15 min，姬氏染色，计数100个巨噬细胞，按下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数。各给药组与模型对照组进行t－检验统计处理。 吞噬百分率 （%）= 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数观察的100个巨噬细胞数×100%

2.4.2 小鼠PHA诱导淋巴细胞转化率实验取小鼠60只，体重18～22 g，随机分为6组，每组10只， ♀♂各半。分别为正常组和CY模型组(蒸馏水20 ml/kg)、阳性药左旋咪唑组(25 mg/kg)、瘰疬清胶囊大、中、小剂量组(16.0，8.0和4.0 g生药/kg)，其中瘰疬清胶囊大剂量相当于拟临床人日用量的24倍。将供试药品在超净工作台中配成相应浓度并紫外线消毒后，各组动物灌胃(ig)给药，给药量均为20 ml/kg，ig1次/d，连续给药8 d，于给药第1天起，每只小鼠每天肌内注射PHA 10 mg/kg ( 0.1 ml/20 g)，共3 d，第6天除空白对照组外，其余各组动物腹腔注射CY 40 mg/kg(0.1 ml/10 g)，第7天重复注射1次，末次药后1 h小鼠眼眶后静脉丛取血，推片，甲醇固定，姬氏染色，水洗，晾干，高倍镜下计数100个淋巴细胞中淋巴母细胞数，按下式计算淋巴细胞转化率。各给药组与模型对照组进行t－检验统计处理。 淋巴细胞转化率 （%）= 转化细胞数转化细胞数+未转化细胞数×100%

2.4.3 小鼠血清溶血素水平测定取小鼠60只，体重18～22 g，随机分为6组，每组10只， ♀♂各半。分别为正常组、CY模型组(蒸馏水20 ml/kg)、阳性药左旋咪唑组(25 mg/kg)、瘰疬清胶囊大、中、小剂量组(16.0，8.0和4.0 g生药/kg)。将供试药品在超净工作台中配成相应浓度并紫外线消毒后，各组动物灌胃(ig)给药，给药量均为20 ml/kg，1次/d，连续给药12 d，于给药后第5天各组动物腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.2 ml/只进行免疫，再于给药后第10天除正常对照组外，每组动物腹腔注射CY 40 mg/kg (0.1 ml/10 g)，第11天重复注射1次，末次给药后1 h小鼠眼眶后静脉丛取血，离心，取10 μl血清用生理盐水稀释100倍，与5%鸡红细胞悬液0.5 ml及10%补体0.5 ml混合，37℃恒温水浴中保温30 min后，0℃冰水浴中终止反应，离心，取上清液于贝克曼DU640型紫外分光光度计540 nm波长处比色，测光密度(OD)值，另设不加血清的空白对照，取上清液作为比色时调0的基准。以OD值作为判定血清溶血素水平的指标。各给药组与模型对照组进行t－检验统计处理。

2.4.4 小鼠血清免疫球蛋白水平测定取小鼠60只，体重18～22 g，随机分为6组，每组10只，♀♂各半。分别为正常组和CY模型组(蒸馏水20 ml/kg)、阳性药左旋咪唑组(25 mg/kg)、瘰疬清胶囊大、中、小剂量组(16.0，8.0和4.0 g生药/kg)，其中瘰疬清胶囊大剂量相当于拟临床人日用量的24倍。将供试药品在超净工作台中配成相应浓度并紫外线消毒后，各组动物灌胃(ig)给药，给药量均为20 ml/kg，1次/d，连续给药8 d，于给药后第6天除正常对照组外，每组动物腹腔注射CY 40 mg/kg (0.1 ml/10 g)，第7天各重复注射1次，末次给药后1 h小鼠眼眶后静脉丛取血，离心，取血清按免疫球蛋白IgG，IgA，IgM测定试剂盒操作方法，于贝克曼DU640型紫外分光光度计340 nm处比色，测光密度(OD)值，生理盐水作为比色时调0的基准。以标准管OD值计算结果。各给药组与模型对照组比较进行t－检验统计处理。

3 结果

3.1 瘰疬清胶囊止咳实验瘰疬清胶囊各给药组与模型对照组比效，均能延长咳嗽潜伏期（P<0.05，P<0.01）；2 min内咳嗽次数明显减少（P<0.001）。结果见表1。结果提示瘰疬清胶囊口服给药能明显延长咳嗽潜伏期和减少咳嗽次数，对小鼠具有明显的止咳作用。

3.2 大鼠肉芽肿实验瘰疬清胶囊大、中、小剂量组的肉芽肿琼脂块与模型对照组相比，均有显著减小(P<0.01，P<0.001)；抑制率达26.5%以上，表明其灌胃给药对慢性炎症性肉芽肿具有明显的抑制作用。结果见表2。

3.3 大鼠足肿胀实验瘰疬清胶囊大、中、小剂量组有明显的抗炎作用。大、中剂量组致炎后4～8 h，小剂量组致炎后6～8 h的足跖肿胀率与模型对照组相比，均有显著降低（P<0.05～0.001）。足肿胀抑制率与模型组比较，大、中、小剂量组4～8 h大于29.7%。结果表明，瘰疬清胶囊对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀具有一定的抗炎作用。结果见表3。

3.4 小鼠免疫实验结果见表4。小鼠CY造模后，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能明显降低（P<0.01）， 瘰疬清胶囊大、中剂量组均能增强腹腔巨噬细胞吞噬功能（P<0.05～0.01），并呈一定的量效关系。 结果表明，瘰疬清胶囊能增强腹腔巨噬细胞吞噬功能，对免疫功能低下的小鼠具有增加免疫功能的作用。 瘰疬清胶囊各给药组小鼠淋巴细胞转化率与模型组比较均有显著性差异(P<0.05～0.001)并呈一定的量效关系，表明瘰疬清胶囊对小鼠淋巴细胞转化反应具有明显的增强作用。 小鼠腹腔注射CY后，使鸡红细胞所致的血清溶血素水平明显降低(P<0.001)，瘰疬清胶囊能明显对抗CY作用， 其中大、中剂量组能显著提高小鼠血清溶血素水平(P<0.01)。 小鼠腹腔注射CY后，血清免疫球蛋白IgG，IgA，IgM水平明显降低(P<0.01～0.001)，瘰疬清胶囊能明显对抗CY作用， 其中中剂量组IgG水平，大、中剂量组IgA水平，大剂量组IgM水平明显提高(P<0.05)。结果表明瘰疬清胶囊能提高小鼠体液免疫功能。

表1 瘰疬清胶囊止咳实验结果（略）

与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n = 10

表2 瘰疬清胶囊对大鼠慢性炎症琼脂肉芽肿的影响（略）

与模型对照组比较，**P<0.01，***P<0.001；n=10

表3 瘰疬清胶囊对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响（略）

与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；（）为抑肿率；n=10

表4 瘰疬清胶囊对小鼠免疫功能的影响（略）

模型组比较 ，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n=10

4 讨论 瘰疬清胶囊临床上长期用于治疗瘰疬、颈部淋巴结核等。本实验室通过动物实验表明该药能明显延长小鼠咳嗽潜伏期和减少咳嗽次数，对大鼠慢性炎症琼脂肉芽肿具有一定的抑制作用，对角叉菜胶致大鼠足肿胀具有一定的抑制作用，瘰疬清胶囊能明显对抗CY作用，提高免疫抑制小鼠的免疫功能，进一步为临床应用提供实验依据。