荜澄茄超临界萃取物工艺筛选及药效学研究

作者：王姿媛，何泽民，姜笑寒

【摘要】 目的筛选超临界CO2 流体萃取荜澄茄挥发性成分的最佳工艺，并研究萃取物的药效。方法采用正交实验设计，以萃取物得率为指标，考察萃取压力、萃取温度、解析压力及解析温度4个因素的影响；采用体外抗菌实验、抗致敏豚鼠回肠肌过敏性收缩反应实验、醋酸扭体法实验、小鼠自主活动次数影响试验研究萃取物的主要药效。结果最佳萃取工艺条件为萃取压力25MPa，萃取温度40℃，解析压力8 MPa，解析温度50℃；萃取物具有显著的抑菌、抗过敏、镇痛、镇静等药理作用。结论超临界CO2 流体萃取技术用于荜澄茄挥发性成分提取，方法简单可行，适用于工业化生产。荜澄茄超临界萃取物具有多方面的药理作用，研究开发价值较大。

【关键词】 荜澄茄；超临界二氧化碳萃取；药理作用

Abstract：ObjectiveTo study the optimal technology of supercritical- CO2 fluid extraction(SFE-CO2) for Litsea cubeba (Lour.)Pres.and its pharmacodynamic effect.MethodsThe yield of extract was used as index to evaluate the technologies based on orthogonal design ， in which 4 factors considered were extraction temperature and pressure ， separation temperature and pressure;the animal models of bacteriostasis，anti-anaphylaxis， analgesia， conscious-sedation were used to study the function of the extract. ResultsThe optimum extraction conditions was extraction pressure 25MPa ， temperature 40℃， separation pressure 8MPa， temperature 50℃ ; The extract had good pharmacodynamic action of bacteriostasis，anti-anaphylaxis， analgesia and conscious-sedation. ConclusionSupercritical fluids extraction method is feasible for the activities of Litsea cubeba(Lour.)Pres.， and useful for the large scale production . The extract has significant functions in many ways and is worthy to further development.

Key words：Litsea cubeba (Lour.)Pres； SFE－CO2 ； Pharmacologic action

中药荜澄茄为樟科植物山鸡椒Litsea cubeba (Lour.)Pres.的成熟果实。具有温中散寒、行气止痛的功效，用于胃寒脘腹冷痛、呕吐、呃逆及寒疝腹痛等症［1］。现代药理研究表明，荜澄茄中的挥发性成分具有多方面的药理作用［2］。目前针对其挥发性成分多采用水蒸气蒸馏法提取。超临界二氧化碳流体的极性相当于正己烷，适于萃取中药中的低极性成分，且具有无溶剂残留，工艺简单，萃取时间短等优点。目前对荜澄茄超临界萃取研究未见报道，本研究以萃取率为指标，采用正交实验设计，筛选荜澄茄超临界CO2 萃取的最佳工艺参数，并研究萃取物的药效，为中药荜澄茄的进一步开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器HA231－50－06型超临界萃取装置，江苏南通华安超临界实业公司；YLS-IA多功能小鼠自主活动记录仪，山东省医学科学院设备站；荜澄茄药材购自广州市清平药材市场，经广州中医药大学生药教研室鉴定为荜澄茄Litsea cubeba (Lour.)Pres.的干燥果实，粉碎成10～20目备用。

1.2 材料NIH种小鼠，体重18～22 g，购自广东省卫生厅医用动物中心。豚鼠（合格证号2006A004），普通级，购自广东省实验动物中心。清热消炎宁：广州敬修堂药业有限公司生产，批号060114。盐酸赛庚啶，2 mg/片，常州四药制药有限公司，批号060812。吗啡注射液：沈阳第一制药厂出品，批号931202。清开灵口服液：广州明兴制药有限公司生产，批号20051101。菌种由北京中国药品生物制品检定所提供。冰乙酸等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 SFE－CO2法提取工艺的基本流程将200 g荜澄茄粉末投入萃取釜中，对萃取釜、解析釜Ⅰ、贮罐分别进行加热，当达到所选定的温度时，开启CO2气瓶对系统进行加压，当达到所选定的力时，开始循环萃取，并保持恒温恒压。待达到选定的萃取时间后，从解析釜Ⅰ出料口出料，得棕黄色的油状荜澄茄萃取物，计算萃取率(萃取率为每100 g药材得到的提取物的量)。 表1 提取工艺4因素3水平正交实验方案及结果（略）

2.2 正交实验选择萃取条件选择萃取压力（A）、萃取温度（B）、解析压力（C）、解析温度（D）4个主要因素，各设定3个水平，设计4因素3水平正交实验L9(34)，对荜澄茄进行超临界CO2萃取，萃取时间为3 h。因素水平及结果见表1，统计分析见表2。表2 萃取率方差分析（略）

以萃取率为指标，则优化工艺为A3B2C2D3，即萃取压力25 MPa，萃取温度40℃，解析压力8 MPa，解析温度50℃。方差分析结果表明，萃取压力、萃取温度和解析温度是有显著影响的因素，各因素影响大小的顺序为A>B>D>C。

2.3 最佳工艺验证实验取荜澄茄药材15 kg（n＝3）按最佳工艺条件进行中试放大实验，各批次的萃取率分别为3.13%，3.21%及3.15%，表明重复性良好，该工艺切实可行。

2.4 体外抗菌作用实验将荜澄茄萃取物以营养肉汤配制成每毫升含生药量3.58，1.79，0.895 g……0.055 9 g，0.027 95 g共8个药物浓度，每管总量2 ml，蒸气灭菌。对链球菌的实验尚需在灭菌药液中添加1%葡萄糖，对肺炎链球菌则加10%灭活兔血清，每排药液的各个浓度管及菌种对照管分别加入1∶2 000的试验菌液（8 h培养物）0.2 ml，37℃培养18 h观察结果。以浊度为指标肉眼观测各管有无菌生长。判定最小抑菌浓度（MIC）。MIC是指完全抑制实验菌种生长所含的最小药物浓度。实验结果见表3（注：菌种对照为不含药物的培养基加试验菌，药物对照为不加试验菌的药液，阳性对照药用清热消炎宁）。表3 药物的抑菌作用（略）

由表3可见荜澄茄提取物对所试菌种均有不同程度的抗菌作用，对各菌的MIC介于0.050 9 g生药/ml～1.79 g生药/ml之间，其中对金黄色葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的作用较强。

2.5 镇痛作用实验小鼠雌雄各半，体重18～22 g，随机分组，分别灌胃给药（吗啡组腹腔注射），1 h后（吗啡30 min后），每只小鼠腹腔注射0.6%冰乙酸0.2 ml，记录注射后20 min内小鼠因疼痛扭体的次数。结果见表4。表4 荜澄茄萃取物对冰乙酸致小鼠疼痛扭体影响的实验(略)

结果表明，荜澄茄萃取物大、中、小剂量组小鼠扭体次数都少于空白组，差异有显著性意义，提示荜澄茄萃取物对冰乙酸所致的小鼠扭体疼痛有镇痛作用。

2.6 抗致敏豚鼠回肠肌过敏性收缩反应实验

取豚鼠10只，体重200～250 g。每只豚鼠两后腿各肌注5%卵蛋白K-H液0.4 ml，同时腹腔注射该溶液1.0 ml以致敏，3周后将豚鼠放血处死，剖腹取回肠，剪成1 cm左右肠段，置入盛有K-H液10 ml的浴槽中，一端固定于浴槽底部的固定钩上，另一端与拉力换能器相连，记录收缩张力（g）。前负荷(1.0～1.5)g，恒温(37±1)℃，平衡15 min后开始实验。实验分为模型组（即生理盐水组）、盐酸赛庚啶组，荜澄茄提取物低、中、高剂量组，各组给药0.1 ml，给药后所达到药物浓度为表中所示。给药后，待药物与标本接触5 min后，向浴槽内加入5 mg/ml卵蛋白K－H液0.1 ml进行抗原攻击，比较各组回肠收缩张力的差别，用t检验比较各组差异，结果见表5。表5 对卵蛋白致敏豚鼠离体回肠肌过敏性收缩反应抑制程度(略) 表5结果表明，模型对照组用抗原攻击后可产生明显收缩反应，与模型对照组比较，盐酸赛庚啶组、荜澄茄提取物低、中、高剂量组，均显著抑制其收缩反应（P<0.01），提示各药物实验组均有明显的抗过敏作用。与盐酸赛庚啶组比较，荜澄茄提取物中剂量组比较无差异(P>0.05)，提示荜澄茄提取物抗过敏作用与盐酸赛庚啶组相当。

2.7 镇静实验－对小鼠自主活动次数的影响实验

取NIH小鼠50只，雌雄各半，体重18～22 g，随机分为5组，每组10只，即为空白对照组、清开灵口服液组、荜澄茄提取物低、中、高剂量组。 除空白对照组外，各组按表6剂量分别灌胃给药，空白对照组给予等容积蒸馏水，每天给药1次，连续4 d。末次给药1，2 h后，将小鼠置小动物自主活动仪中，使其适应3 min后，记录5 min内活动次数，采用重复测量的方差分析进行组间比较结果见表6。表6 对小鼠自主活动的影响(略)

表6结果表明，与空白对照组比较，清开灵口服液组、荜澄茄提取物低、中、高剂量组，均能显著减少小鼠5 min内的自主活动次数（P<0.01），提示各实验组均有较好的镇静作用。与清开灵口服液组比较，荜澄茄提取物高、中剂量组给药2 h后对减少小鼠5 min内的自主活动次数均有差异（P<0.05），提示荜澄茄提取物镇静作用强度相当于清开灵口服液。

3 讨论

超临界萃取法比常规水蒸气蒸馏法的萃取效率高，且无溶剂残留，有利于环境保护，工艺简单、萃取时间短。目前已广泛应用于中药材的提取中，成为中药现代化进程中的一项重要技术。本实验采用超临界技术提取的荜澄茄提取物为棕黄色的油状物，有效成分被高度浓缩，有利于本品的进一步开发利用。

本实验在工艺优化时，考察了温度和压力等主要因素。另外，二氧化碳流量也是重要的影响因素。CO2流量［升/（秒·千克原料）］的变化对超临界流体萃取过程的影响较复杂。当加大CO2流量，会产生有利和不利两方面的影响。在实际应用中，我们根据成本和效率的原则确定萃取过程的流量。 荜澄茄成人临床用量为生药量0.35 g/kg体重。药效实验时用50%聚乙二醇400配制成所需浓度，按15.75，5.25，1.75 g生药量/kg剂量给药，相当于临床用量的45，15，5倍。 本实验结果表明，荜澄茄超临界提取物具有显著的抑菌、镇痛、镇静、抗过敏作用，且毒性低，从而验证了荜澄茄超临界流体萃取工艺的合理性，同时也为荜澄茄的制剂工艺及活性成分的研究奠定了良好的基础。