关于人野生型p53肿瘤抑制基因在烟草中的遗传转化

【摘要】 目的： 构建人野生型p53肿瘤抑制基因的植物表达载体，并建立p53转基因烟草植株. 方法： 将人野生型p53肿瘤抑制基因编码区克隆于pUC19， pBI426和pCAMBIA2301载体，构建含人野生型p53基因的植物表达载体pCAMBIA2301/p53，p53基因由2×CaMV 35S启动子控制表达. 利用叶盘共培养法经根瘤农杆菌EHA105介导转化烟草，获得转基因烟草植株；用组织化学法，PCR、Southern杂交检测转基因烟草植株. 结果： 经组织化学法，PCR， Southern杂交检测表明人野生型p53基因已整合到转基因烟草植株的基因组中，并获得了的转p53基因烟草植株. 结论： 成功建立了含人野生型p53基因的转基因烟草植株，为进一步检测p53基因的生物活性和开辟生产药用蛋白的新途径奠定了基础. 【关键词】 人野生型p53基因；转基因烟草；根瘤农杆菌；基因转化；抗菌药 【Abstract】AIM: To construct the plant transformation vector containing human wildtype p53 tumor suppressor gene and establish human wildtype p53 transgenic tobacco plants. METHODS: The human wildtype p53 coding sequence was subcloned into vectors pUC19， pBI426 and pCAMBIA2301 to obtain plant expression vector pCAMBIA2301/p53. TDNA regions of the pCAMBIA2301/p53 binary vector contained constitutive 2×Cauliflower mosaic virus (2×CaMV) 35S promoter， nopaline synthase terminator， and neomycin phosphotransferase Ⅱ(npt Ⅱ)gene， which allowed the selection of transformed plants against kanamycin. The tobacco (Nicotiana tobacum L.Cuttivar Xanthi) plants were transformed by cocultivating leaf discs method via Agrobacterium tumefaciens EHA105 harboring the plant expression vector. The generated transgenic tobacco plants were selected by kanamycin， and identified by histochemical assay， PCR， Southern blot. RESULTS: Histochemical assay， PCR and Southern blot analyses demonstrated the stable integration of the human wildtype p53 gene into the tobacco genome.Transgenic tobacco plant with p53 gene was obtained successfully. CONCLUSION: Transgenic wildtype p53 tobacco plants have been established， which can serve as a base for further studies on detecting the biological activities of p53 gene and exploiting the new way of producing pharmaceutical proteins. 【Keywords】 human wildtype p53 gene; transgenic tobacco; Agrobacterium tumefaciens; gene transformation; antibacterial agents 0引言 人类癌症中最常见的基因改变是p53基因突变，它是癌基因研究中重要的肿瘤抑制基因之一，野生型p53基因与细胞周期的生长调节、细胞转化的调节、DNA复制以及诱导细胞程序性死亡有着密切关系［1-2］. 本研究利用转基因植物作为生物反应器的优点，将人野生型p53肿瘤抑制基因构建于植物表达载体，通过根瘤农杆菌介导的转化方法将其转入烟草，获得表达人野生型p53基因的转基因植株，为今后借助转基因烟草或其它转基因植物作为生物反应器生产人野生型p53蛋白奠定了基础. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1质粒、菌株人野生型p53肿瘤抑制基因由赵永同博士惠赠，植物表达载体pCAMBIA2301，根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，大肠杆菌（Ecoli.）DH5α，pUC19为本实验室保存. 1.1.2主要试剂各种限制性酶、Tag聚合酶、质粒快速提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒等购自TaKaRa公司和上海生工生物工程技术服务有限公司；高效地高辛 DNA标记检测试剂盒购自Roche Molecular Biochemicals公司. 头孢曲松钠购自上海先锋药业公司；卡那霉素购自华美生物工程公司，其他常规试剂均为国产分析纯试剂. 1.1.3培养基LB及MS 培养基按参考文献方法配制［3］. 浸染培养基：MS0+ AS（400μmol/L）+ pluronic F68 (0.5 mg/L)，AS和pluronic F68在浸染前加入. 共培养基：MS+BA(1 mg/L)+NAA(0.1 mg/L) + AS (400 μmol/L)+pluronic F68 (0.5 mg/L). 选择培养基：MS+BA (1 mg/L)+ NAA (0.1 mg/L )+Kanamycin (100 mg/L)+头孢曲松钠. 头孢曲松钠浓度依次为50 mg/L， 100 mg/L， 150 mg/L， 200 mg/L， 300 mg/L， 400 mg/L， 500 mg/L， 600 mg/L. GUS显色液按

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