关于烟草浸提液对大鼠体外培养成骨细胞的影响

作者：王桂龙 侯玉东 石玲波

【摘要】 目的 探索烟草浸提液对体外培养成骨细胞的附着和生长的影响。方法 将周龄SD大鼠颅盖骨，剪成1.5 mm×1.5 mm大小组织块，先用0.25％胰蛋白酶消化20 min、0.1％Ⅱ型胶原酶消化30 min后，再对其进行培养。倒置显微镜观察细胞形态，并对其碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力进行鉴定。实验分对照组和实验组，实验组按所加烟草浸提液浓度的不同分为0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50 g／L 7个浓度组，分别测定各实验组细胞的生长曲线。采用SPSS13.0软件包对数据进行双因素方差分析。结果 烟草浸体液对成骨细胞的附着和生长起抑制作用，并随其浓度的升高而增强。各处理组间存在显著差异（P＜0.01）；各组内的前3 d存在显著性差异（P＜0.01），但3.2～50 g／L组第4～7天间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 吸烟不利于口腔种植的临床愈合。 【关键词】 成骨细胞；原代培养；SD大鼠；烟草浸提液 【Abstract】 Objective To investigate the effects of smokeless tobacco extract(ST) on the attachment and growth of the rat’s osteoblasts in vitro.Methods The bone tissues from the calvaria in rats aged 1 week were cut into blocks of 1.5 mm × 1.5 mm.They were digested by 0.25％ trypsinase for 20 minutes and by 0.1％ collagenase II for 30 minutes and then the liquid supernatant was abandoned. The bone blocks were cultured to acquire isolated cells.The identification was conducted by cell morphology，histochemical staining of alkaline phosphatase (ALPase)and calcified nodules staining.The experiments were pided into control group and experiment groups.The experiment groups were pided into seven groups by the smokeless tobacco extract’s concentration: 0.8，1.6，3.2，6.4，12.5，25 and 50 g／L， then the cell growth curves were drawn. Statistical analysis was performed using SPSS13.0 software package for twoway ANOVA.Results ST inhibited attachment and growth of osteoblasts in all groups with a concentrationdependent manner. The difference among all of groups was significant（P＜0.01）; the difference between the same group was significant before 3 days（P＜0.01）， while the difference among 3.250 g／L groups was no significant after 4 days（P＞0.05）.Conclusion Smoking is harmful to the clinic healing of oral implant operation. 【Key words】 osteoblast，primary culture，rats，smokeless tobacco extract 目前，口腔种植技术因其独特的优势而获得了临床医师及患者的青睐，而骨结合则是其成功的基础。骨组织作为一种特殊的钙化组织，主要由成骨细胞完成并受体内多种因素调控。随着细胞培养技术的发展，成骨细胞的体外培养成为可能。体外培养的成骨细胞可以排除体内多种因素的相互影响，从而为骨形成和代谢机理方面的研究提供有价值的实验依据。目前成骨细胞原代培养的方法主要有2种：酶消化法和组织块法［1，2］。酶消化法虽可获得大量细胞，但获得的细胞不纯。本实验拟采用酶消化后再对组织块进行培养的方法来获得纯度较高的成骨细胞，观察烟草浸提液对成骨细胞的附着及生长的影响，以期证明吸烟是影响口腔种植的不利因素之一。 1 材料和方法 1.1 器材和试剂 1.1.1 主要仪器设备和材料:超净工作台 (苏州集团安泰公司)；CO2培养箱 (Heraeus)；荧光倒置显微镜 (日本OLYMLOS)；眼科手术器械（上海手术器械厂）；血球计数板（镇江市丹徒科达医疗用品厂）；50 ml玻璃培养瓶（Costar）；离心机（雷动尔LDZ52）；高糖DMEM（Ｇibco）；胰蛋白酶（Amresco）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；胶原酶（Invitrogen）；烟草（成品盒装香烟，烟气烟碱量1.2 mg，焦油量13 mg）；SD大鼠（烟台绿叶实验动物中心）。 1.1.2 主要试剂的配制:①含烟草浸提液培养液的配制［3］:称取5 g成品盒装香烟的烟丝，加入0.1 L的双蒸水，在37℃ 孵育箱中浸泡48 h，过滤除菌，将此浓度定为50 g／L。用含15 ml／L胎牛血清的DMEM培养液配制含烟草浸提液的培养液，其浓度分别为0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50 g／L 7个浓度组。②成骨细胞矿化培养液的配制:DMEM培养基中加入双抗(含青霉素100 U/ml 、链霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3。含矿化液的DMEM培养基中加入双抗(含青霉素100 U/ml 、链霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3、β甘油磷酸钠1×10-2mol/L、维生素C 50 mg/ml、地塞米松1×10-7mol/L。孵育液含3%β甘油磷酸钠5 ml，2%巴比妥钠5 ml，2%硝酸钙10 ml，2%MgSO4 5 ml，蒸馏水25 ml。 1.2 实验方法 1.2.1 大鼠成骨细胞的原代培养：周龄SD大鼠处死后用75％酒精浸泡5 min，倒置显微镜下取其颅顶骨，以无菌DHanks(含青霉素100 U/ml 、链霉素100 U/ml)冲洗，刮去骨膜、剪去骨缝间结缔组织，制成约1.5 mm×1.5 mm大小的碎块，以DHanks液冲洗3次，加入0.25% 胰蛋白酶37℃下震荡消化20 min，弃上清，0.1%的II型胶原酶消化30 min后弃上清；所得骨块直接放入培养瓶中加入含20% 胎牛血清的DMEM 培养液，置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。 1.2.2 细胞培养及传代：在原代培养过程中，每3～4 d换液1次，细胞长满瓶底时开始传代，传代时用差速贴壁法进行纯化［4］。0.25% 胰蛋白酶37℃消化10 min左右，当观察到细胞形态变圆，且部分细胞已开始脱离瓶底时，终止消化，离心后加入培养液进行传代，每瓶细胞可传代2～3瓶。传代3～5次后，成骨细胞得到纯化，用于实验。 1.2.3 成骨细胞鉴定：①荧光倒置显微镜下对细胞形态的变化及生长状况每日进行观察。②碱性磷酸酶组织化学染色(改良Gomori钙钴法) 将纯化后的第2代细胞接种于盖玻片上，接种密度为1×104 /cm2。待细胞长至汇合后取出盖玻片，以常规Gomori钙钴法染色。玻片无菌冲洗2次后用冷丙酮（4℃冰箱保存）固定细胞10 min，蒸馏水冲洗数次，放人孵育液中37℃孵育4～6 h，然后依次入2％硝酸钴5 min，蒸馏水冲洗数次。1%硫化铵中浸2 min，自来水冲洗，自然晾干，甘油明胶封片。③将第4代成骨细胞接种爬片，用含矿化液的培养基培养3周，在倒置显微镜下可见白色结节， PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min。再用PBS冲洗2次，0.1%茜素红TrisHCl（pH8.3）染色30 min，用PBS冲洗，晾干、封片。 1.2.4 成骨细胞生长曲线的测定：取3瓶体外培养的成骨细胞，用适量0.25%的胰蛋白酶消化10 min，离心后加入25 ml培养基，吹打成细胞悬液后，计数板计数其浓度为1.35×105/ml。取24孔培养板8块，滴加细胞悬液入其内，每孔0.1ml，培养10 h使成骨细胞能贴壁生长，测其贴壁率。而后每块培养板内各孔分别加入含不同浓度烟草浸提液的培养基0.9 ml，每浓度组为3孔，细胞每3 d换液一次。从加入烟草浸提液始每24 h计数1次。 1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件包对数据进行双因素方差分析，实验数据用 x±s表示，P＜0.01为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 成骨细胞形态学观察 酶消化后对组织块继续培养3天，倒置显微镜下观察发现骨块周围有少量细胞长出，靠近骨块处圆形细胞多见，远离骨块处体积较小的梭型细胞常见；5 d后观察，细胞数量较多，呈梭形、三角形或不规则多边形，分化成熟者可见有3～4个突起。传代后细胞以梭形、三角形为主，呈集落样生长趋势，最终可连接成片，出现重叠生长现象（图1）。 2.2 碱性磷酸酶（ALP）组织染色 ＡＬＰ组织染色（改良Gomori钙钴法）测定为阳性，显示成骨细胞呈黑灰色着色（图2）。 2.3 成骨细胞矿化结节茜素红染色观察 成骨细胞生长融合成复层后，不经传代继续培养，形成钙化结节后行茜素红染色，显微镜下黑色的结节染成红色 (图3)。

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