加急见刊

10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶迭代饱和突变与活性位点分析

张育楠; 陈天娇; 朱平 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/国家卫生健康委员会天然产物生物合成重点实验室; 北京100050

摘要：目的利用迭代饱和突变技术进-步提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶双突变体DBATG38R/F301V的活性;通过丙氨酸扫描确定DBAT活性中心的重要位点.方法利用迭代饱和突变技术在现有双突变体DBAT^G38R/F301V的基础上对Ser^396进行半饱和突变,筛选对10-去乙酰紫杉醇（DT）催化活性提高的突变体;对获得的高活性突变体蛋白进行催化DT的最适温度和最适pH测定;在最适pH条件下,将其分别用最适反应温度和0℃温育6h,考察该蛋白的热稳定性;采用生物信息学方法分析活性提高的分子机制.对DBAT底物结合区域尚未进行分析的几个氨基酸进行丙氨酸扫描研究,分析这些位点在DBAT催化10-DAB和DT过程中的作用.结果获得了三突变体DBAT^G38R/F301V/S396I,其催化DT的活性为DBAT^G38R/F301V的1.6倍,该蛋白催化DT的最适条件为37.5℃,pH7.5;该蛋白在37.5℃静置6h后催化DT的活力为初始值的30%,在0℃静置6h后为初始值的70%;丙氨酸扫描结果显示,Asn^45在DBAT催化10-DAB和DT时都非常重要,而Asn^42、Glu^350、Glu^355和Lys^389位点对催化10-DAB的影响更大.结论将活性口袋内的亲水性氨基酸向疏水性氨基酸突变可能有利于DBAT对DT的催化,但氨基酸侧链的长度和空间构型也是影响催化活性的重要因素;发现Asn^45可能是-个潜在的DBAT催化或底物结合位点.

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