碳纳米管表面绿原酸印迹固相萃取材料的制备及应用

作者：张华斌 张朝晖 聂燕 胡宇芳 邹海英 姚守拙

【摘要】 在多壁碳纳米管表面接枝的双键键合，以绿原酸为模板，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用沉淀聚合技术，在碳纳米管表面成功制备绿原酸印迹材料。采用红外光谱、扫描电镜和热重分析研究此印迹材料的性能。结果表明，在碳纳米管表面接枝一层稳定、均匀、30～40 nm厚的印迹材料。采用高效液相色谱研究此印迹材料的吸附动力学及吸附容量，实验结果表明，此印迹材料对绿原酸的结合存在两个结合位点，最大吸附容量Qmax分别为21.5和32.７ μmol/g。以此印迹材料作为固相萃取剂，优化萃取条件，成功应用于金银花提取液中绿原酸的富集分离研究，富集因子达25。

【关键词】 多壁碳纳米管，分子印迹，绿原酸，分离

Abstract A novel molecularly imprinted polymers (MIPs) was prepared based on multiwalled carbon nanotubes (MWNTs) by using chlorogenic acid as template， methacrylic acid(MAA) as the functional monomer， and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) as the crosslinker. Infrared spectroscopy， scanning electron microscopy， and thermogravimetric analysis were employed to characterize the composite structure and morphology， the results showed that a stable imprinted layer was grafted on the MWNTs with the average thickness of 30－40 nm. The dynamic adsorption and static adsorption experiments were also executed and the results showed that two kinds binding sites with the maximum apparent binding constant 21.5 μmol/g and 32.７ μmol/g existed v.i. between the imprinted polymers and chlorogenic acid. As solid phase extraction (SPE) materials， the separation and enrichment of chlorogenic acid from honeysuckle were successful with a enrichment factor of 25.

Keywords Multiwalled carbon nanotubes， molecularly imprinted， chlorogenic acid， separation

1 引 言

分子印迹技术是一种合成具有特异性识别位点和预定选择性聚合物的技术，该技术已经在诸多领域得到应用，如固相萃取、手性分离、化学传感等[1～3]。最近，有科研工作者以碳纳米管为基材，结合印迹技术，制备具有高选择性和高吸附容量的碳纳米管分子印迹聚合物(MWNTsMIPs)，并成功用于电化学等领域研究[4～10]，但在色谱研究领域却鲜有报道。本实验以多壁碳纳米管为基体，通过酰胺化反应在碳纳米管表面接枝碳碳双键，以绿原酸为模板，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，通过热聚合在碳纳米管表面接枝绿原酸印迹层。对此印迹材料进行扫描电镜分析、红外分析、热重分析和高效液相色谱分析，并成功应用于金银花粗提液中绿原酸的固相萃取。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LC10AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；S3400N扫描电子显微镜（日本日立公司）；WGH30A型双光束红外分光光度计(天津港东科技发展有限公司)；WCT2C型微机差热天平(北京光学仪器厂)；台式高速离心机(北京医用离心机厂)。 多壁碳纳米管(MWNTs，30～40 nm， 纯度>99%， 深圳比尔科技公司)；绿原酸标准品(CA，中国药检局)；金银花(湖南吉首市)；甲基丙烯酸(MAA，Sigma公司)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，Sigma公司)，使用前蒸馏除去阻聚剂。偶氮二异丁腈(AIBN，北京化工厂)、HNO3、二氯亚砜(SOCl2)、N，N′二甲基甲酰胺(DMF)、丙烯酰胺(AM)、乙腈(ACN)、醋酸、醋酸钠、甲醇和乙醇除特殊说明外，均为分析纯试剂。实验用水为二次蒸馏水。

2.2 MWNTsCONHCHCH2的制备

称取500 mg MWNTs，加入50 mL浓HNO3，超声10 min， 85 ℃下回流搅拌24 h。冷却后，将反应液稀释10倍，用0.45 μm微孔滤膜减压抽滤。滤饼采用二次蒸馏水反复洗涤至中性，于85 ℃真空干燥24 h，得到MWNTsCOOH，称重备用。

称取450 mg MWNTsCOOH，加入50 mL SOCl2，于70 ℃回流搅拌24 h。反应完成后，常压蒸馏出未反应的SOCl2，然后加入3.0 g AM和100 mL DMF，溶液超声10 min，在45 ℃回流24 h。采用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤饼先以0.12 mol/L HCl洗涤，再用水洗至中性，于70 ℃真空干燥24 h，得到MWNTsCONHCHCH2，称重备用。

2.3 印迹材料(MWNTsMIPs)的制备

绿原酸印迹材料的合成条件如表1所示。称取适量MWNTsCONHCHCH2和绿原酸，再依次加入MAA、EGDMA、AIBN和ACN。溶液通氮气10 min，将反应器密封。再超声10 min，静置1 h，然后于60 ℃下搅拌反应24 h。空白印迹材料(MWNTsNIPs)的制备除不加模板分子外，其它步骤相同。 聚合物冷却至室温，以10000 r/min离心收集聚合物沉淀，用20%醋酸甲醇溶液(V/V)反复洗涤以除去模板分子及未聚合的功能单体和交联剂，然后用无水甲醇洗脱醋酸，每次洗脱液都以10000 r/min离心10 min，收集产物于90 ℃真空干燥24 h，得到MWNTsMIPs。表1 MWNTsMIPs的聚合条件（略） 2.4 印迹固相萃取

2.4.1 优化固相萃取条件

称取300 mg MWNTsMIPs和MWNTsNIPs，采用干法装入固相萃取柱中，两端用玻璃棉封堵。填充柱先用10 mL甲醇清洗，再用蒸馏水清洗。对固相萃取过程的工艺优化如下：首先上样10 mL 0.5 mmol/L绿原酸乙醇溶液，打开真空泵，控制流速0.5 mL/min，用乙醇淋洗除去非特异性吸附的干扰物质后，使用50 mL不同pH值的醋酸/醋酸钠缓冲溶液甲醇(2∶8， V/V)洗脱剂洗脱被萃取柱保留的模板分子，收集含有绿原酸的洗脱液，浓缩再定容，用HPLC分析。通过对比洗脱液中绿原酸含量和上样中绿原酸含量计算回收率。使用空白印迹材料做对照实验。

2.4.2 金银花中绿原酸的富集

采用与2.４.1节优化后的方法上样10 mL金银花的乙醇粗提液，采用50 mL pH 3.3的醋酸/醋酸钠缓冲溶液甲醇(2∶8， V/V)洗脱剂洗脱，流速控制为0.5 mL/min， 采用HPLC检测接收液， 考察绿原酸在MWNTsMIPs固相萃取材料上的保留情况。

2.5 色谱条件

实验中所有的HPLC测定的色谱条件相同，即：VPODS C18色谱柱(150 mm×4.6 mm)，柱温30 ℃；流动相：V(甲醇)∶V(水)=40∶60，流速1.0 mL/min；检测波长327 nm。

3 结果与讨论

3.1 MWNTsMIPs的聚合与表征

3.1.1 MWNTsMIPs的聚合

可以根据需要在碳纳米管表面接枝不同的官能团。本实验利用酰胺化反应，在碳纳米管表面接枝丙烯酰胺的双键，使MWNTs与MIPs之间实现共价键连接，聚合过程如下：

3.1.2 电镜分析

采用扫描电镜对MWNTs和MWNTsMIPs进行形貌表征，如图1所示。从图1a中可以清晰的看到MWNTs呈单一的纳米管状，其管径约为30～40 nm。同样放大30000倍可见，MWNTsMIPs已经均匀变粗，管径约为100～120 nm，这表明绿原酸印迹材料均匀地接枝在MWNTs上，由此估算出接枝在碳纳米管表面的印迹材料的厚度约为30～40 nm。

3.1.3 热重分析

MWNTs和MWNTsMIPs的热重分析结果如图2所示。在100 ℃内都有未干燥完全的溶剂(水，乙腈等)挥发；在100～600 ℃之间MWNTs没有明显失重，而MWNTsMIPs有两处明显的失重，这两种失重可能是因为MIPs与MWNTs的两种不同包覆，在350 ℃附近的失重是物理性的包覆，而400～600 ℃间的失重是存在化学键的包覆。因此，扣除溶剂的失重损失(在100 ℃之前)，估算出MWNTs表面MIPs的接枝率约为83%。

3.1.4 红外光谱分析

图3是MWNTsMIPs、MWNTsCONHCHCH2和MWNTs的IR谱图。谱线a中3600～2900 cm－１之间较宽的吸收峰是CH3和NH的伸缩振动峰重叠的结果；1733 cm－１是CO伸缩振动峰，1171 cm－１是CO的对称振动峰。在MWNTsCONHCHCH2(谱线b)中，1628 cm－１处有CC振动峰。而3315和1679 cm－１分别是酰胺化的缔合NH伸缩振动峰及CO峰。

3.2 MWNTMIPs的吸附动力学

称取一系列50 mg分子印迹材料，置于10 mL吸附管中，分别加入10 mL 0.5 mmol/L绿原酸甲醇溶液，于25 ℃恒温振荡器中振荡10、45、80、120、200、300和500 min后，10000 r/min离心，用高效液相色谱(HPLC)测定上层清液中绿原酸的浓度，平行测定3次，取平均值，差减法计算印迹材料对绿原酸的结合量Q(μmol/g)。MWNTsMIPs对绿原酸的吸附动力学的结果如图4所示。对图4作S形拟合，可以发现在120 min前，MWNTsMIPs的吸附量随时间增加迅速增大，表明在此阶段的吸附速度很快，但是在120 min后，就趋于平衡，表明吸附容量达到饱和而不再增加。

3.3 印迹材料的吸附性能

称取一系列50 mg分子印迹聚合物，置于10 mL吸附管中，分别加入0～4.00 mmol/L的不同浓度的绿原酸甲醇溶液，放入25 ℃恒温振荡器中振荡12 h，10000 r/min离心，用ＨＰＬＣ测定上层清液中绿原酸的浓度，平行测定3次，取平均值，差减法计算印迹材料对绿原酸的结合量Q(μmol/g)。采用静态吸附法，测定了MWNTsMIPs对不同浓度绿原酸的吸附等温线，结果见图5a。将图５a中数据进行Scatchard模型[2]分析，以Q/C对Q作图可得到图5b。由图5b可见，Q/C对Q呈非线性关系; 但图5b中两个部分呈线性关系，表明MWNTsMIPs对绿原酸存在两种不同结合位点。高结合位点的离解常数Kd1=0.13 mmol/L，最大吸附量Qmax1=21.5 μmol/g；低结合位点的离解常数Kd2=0.76 mmol/L，最大吸附量Qmax2=32.７ μmol/g。

分别比较甲醇、乙醇和水配制的绿原酸溶液进行固相萃取的效果， 发现绿原酸的乙醇溶液吸附率达到100%， 而甲醇和水溶液的吸附率约70%。由于模板分子与功能性单体之间发生的主要是氢键作用，弱极性溶剂配制的样品更有助于模板分子与萃取材料的结合，上样溶剂的极性过大将干扰模板分子与印迹孔穴氢键作用，3种溶剂极性以乙醇最弱。因此本实验选取廉价的乙醇作为上样溶剂及淋洗液。

将绿原酸分别在MWNTsMIPs与MWNTsNIPs固相萃取柱上进行吸附和洗脱，检测结果见表2。用不同pH值（3.3、4.5、6.6和7.9）的醋酸/醋酸钠缓冲溶液甲醇（2∶8， V/V）为洗脱液时，pH越低，回收率越高，这可能是乙酸的羧基与功能单体竞争性地与模板分子作用，破坏模板分子与印迹位点间的氢键作用，从而使模板分子从印迹位点被释放。当pH<3.3， 再降低pH值，洗脱效果无明显提高。同时乙酸浓度过高会降低萃取柱使用寿命，所以最终选择20%醋酸/醋酸钠（pH 3.3）甲醇溶液为洗脱液。表2 绿原酸的回收率（略）

金银花的粗提液分别通过MWNTsMIPs和MWNTsNIPs固相萃取柱，以乙醇为淋洗液，pH 3.3的醋酸/醋酸钠缓冲溶液甲醇溶液为洗脱液进行固相萃取，洗脱液用HPLC检测，色谱图如６所示。上样液中绿原酸含量约3%，在pH=3.3醋酸/醋酸钠缓冲溶液甲醇（2∶8， V/V）的洗脱下，绿原酸在MWNTsMIPs柱得到分离和富集，含量提升到90%，富集因子约为25倍。