纳米复合羟基磷灰石（nHA）根管充填材料的应用基础研究

【摘要】 目的 通过对纳米羟基磷灰石复合根充材料与传统根管充填材料（充填用复方麝香草酚散甲醛甲酚复合制剂）进行细胞毒性、根管密合性及抑菌性的对比研究，评价纳米羟基磷灰石复合材料的细胞毒性、根管壁密合度以及抑菌作用。材料与方法 细胞毒性实验：体外培养成骨细胞，添加纳米羟基磷灰石复合材料浸提液，并以培养液为阴性对照组，充填用复方麝香草酚散甲醛甲酚复合糊剂为阳性对照组。根据ISO标准采用MTT法进行体外细胞毒实验，测试不同浸提时间的材料浸提液与成骨细胞接触1、3、5、7天的吸光度值，以评价其细胞毒性。根管密合性实验：将10颗近期拔除的单根牙随机分成2组，每组牙齿按常规方法进行根管预备。实验组为40%纳米羟基磷灰石复合糊剂充填，对照组为充填用复方麝香草酚散甲醛甲酚复合糊剂充填。拍X线片以保证各组中实验离体牙牙根均完善充填，充分硬固后，进行微渗漏试验。改良葡萄糖检测微渗漏分析装置进行根管密合度实验，30天后结果由葡萄糖定量分析仪测定。抑菌性实验：将蘸有营养肉汤培养液的棉拭子反复擦感染根管，进行细菌接种、分离、鉴别、培养。培养结果为变型链球菌、金黄色葡萄球菌二种可利用菌种，分别用血培养基、普通培养基分别培养，对实验组与对照组充填材料进行抑菌性实验，观察抑菌环大小，检测出每组药物的抑菌环直径，取平均值计算。结果 细胞毒性实验：实验组与阴性对照组无显著差异（P＞0.05），实验组与阳性对照组有显著差异（P＜0.05）。根管密合性试验：对照组葡萄糖浓度明显高于实验组，有显著性差异（P＜0.05）。抑菌性实验：各组根充糊剂均有良好抑菌性，实验组与对照组统计学差异不显著（P＞0.05）。结论 纳米羟基磷灰石根充材料体外细胞毒性实验阴性，有良好的生物相容性。纳米羟基磷灰石复合根充材料其与根管壁密合度方面明显优于充填用复方麝香草酚散甲醛甲酚复合糊剂，并具有良好的抑菌性。

【关键词】 纳米羟基磷灰石 根管充填 细胞毒性 微渗漏 抑菌性

根管治疗术发展的总趋势之一是研究无致癌倾向的、能够严密堵塞根管的充填材料。本研究寻找一种新型的根管充填材料，有助于提高根管治疗术的疗效，更好地服务于口腔临床。

1 材料和方法

1.1 实验器材 纳米羟基磷灰石，由南京爱普瑞纳米材料有限公司；碘仿，哈尔滨市东北齿科材料加工厂；聚乙烯醇，国药集团化学试剂有限公司；充填用复方麝香草酚散甲醛甲酚复合制剂，上海二医张江生物材料有限公司；MTT，美国GIBCO公司；二甲基亚砜，美国GIBCO公司；胎小牛血清，美国Sigma公司；DMEM培养液，美国Gibco公司；SD大鼠，浙江大学生物实验中心。裂钻、根管扩大针，登士柏牙科有限公司；肉汤培养基、厌氧培养基（GAM）、需氧培养基（BA）、厌养罐、微量生化管，明新生物技术研究所；BioRADModel-550酶联免疫酶标仪，美国Sigma公司；二氧化碳培养箱，美国热电集团；Olympus IX-70倒置相差显微镜，日本OLYMPUS公司；超净工作台VS-1300-U，苏州安泰空气技术有限公司；S2309A型牙科椅，西北医疗器械（集团）有限公司；ELITYS数字X光牙片机，上海复星医疗器械有限公司；广口瓶、粘蜡、1mol/L无菌葡萄糖溶液、2ml／瓶无菌蒸馏水装置、改良葡萄糖滴定微渗漏仪，佳木斯大学附属口腔医院。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞毒性实验

1.2.1.1 材料浸渍液的制备 采用DMEM培养液配制纳米羟基磷灰石根充糊剂浸提液。称取20纳米羟基磷灰石0.5g经高压灭菌后加入DMEM培养液10ml。振荡混匀后在CO2细胞培养箱中37℃放置3d，3000r/min离心5min后取上清液，经滤过除菌，放入4℃冰箱保存。实验共分3组：实验组为20纳米羟基磷灰石浸提液，DMEM培养液为阴性对照组，0.05g/ml新调制的充填用复方麝香草酚散甲醛甲酚复合制剂浸提液为阳性对照组。观察成骨细胞在不同培养液中的生长繁殖情况。

1.2.1.2 实验动物与成骨细胞培养 新生3～5d SD大鼠，体重4～6g。在无菌条件下处死，75%乙醇中浸泡5min，无菌条件下取颅顶骨，放大镜下彻底去净附属组织，剪成1mm3小片，D-Hank，s液洗涤3次， 用0.25%胰蛋白酶在37℃消化30min，然后移入0.1%胶原酶溶液中，37℃下震荡消化60min，将含细胞的消化液在1500r/min下离心2次，每次5min沉淀物用DMEM培养液制成细胞悬浊液，将细胞悬浊液按5×104/ml接种于96孔培养板加入DMEM培养液在37℃、饱和湿度，5%CO2和95%空气孵箱内进行培养，培养液中加入含有20%胎牛血清，待培养至70%～90%贴壁，细胞生长良好融合成单层后再传代。

1.2.1.3 体外培养细胞悬液的配制 取生长良好的第四代成骨细胞，0.25%胰蛋白酶消化，毛细吸管吹打使贴壁细胞脱落，显微镜下记数，调整细胞数为5×107个/L，接种入96孔板中，用加入含20%胎牛血清的DMEM培养基200μL培养6h，制成细胞悬液。

1.2.1.4 MTT比色法检测 待细胞贴壁生长后舍弃原培养液， 分别加入含50g/L新调制的对照组制剂培养液，新鲜DMEM培养液，实验组浸提液， 用96孔板每个实验组6孔，放入培养箱中培养，于3d、5d更换材料浸提液，于培养后1、3、5、7d 各取一块培养板，然后每孔加入20μlMTT(5g/L) 溶液后37℃孵箱继续培养4h，小心吸出每孔内的浸提液，加入二甲基亚砜每孔150μl，室温下16min后振荡器振荡培养板10min使结晶物充分溶解染色均匀，用酶联免疫检测仪在500nm波长测定各孔光吸收值，取6孔均值为样本检测值。

1.2.2 根管密合性检测 收集近期拔除的单根离体牙10颗。标准：牙齿包括根尖孔，发育正常，无病变及折裂伤。刮净结石及牙周膜纤维，放生理水中备用。10颗离体牙随机分成实验组及对照组。开髓，根管预备至40＃，纸尖吸干根管，室温放置。将各组根充后的牙齿拍Ｘ光片证实所有牙根均完善充填。待材料充分硬固后，进行微渗漏试验并检测葡萄糖浓度。

1.2.3 根管充填材料的抑菌实验 用琼脂稀释法，提取3～5个大小菌落入布氏培养液中作厌氧培养，24h后将二种菌按1:10稀释并校正为1.5×108CFU/ml浓度待用，并将2种根充糊剂分别稀释至0.9ug/ml待用。采用打孔琼脂扩散法，将琼脂均匀注入培养皿，待凝固后，用直径为1cm的打孔器打孔，每个平板上均匀打孔2个，挑出孔中琼脂，在孔中注入琼脂1.0ml封孔底. 将校正后菌液涂布于均匀平皿表面，每种菌需涂布于3块培养皿上，将稀释的根充糊剂100mg加入后，将各培养皿置于37℃恒温箱内培养48h观察结果。使用卡尺测量加药孔周围无菌生长区域的大小，即抑菌环直径，测抑菌环的最大直径和最小直径取均值。

1.3 统计学分析 应用SPSS11.5统计软件进行数据处理，采用单因素方差分析和t检验。

2 结果 实验组和阴性对照组细胞毒性无显著性差异（P＞0.05）；实验组与阳性对照组有显著差异（P＜0.05），见表1。实验组与对照组根管密合度之间有显著性差异（P＜0.05），见表2。实验组与对照组抑菌试验之间无显著性差异（P＞0.05）见表3、表4。

表1 对照组及实验组OD值（略）

表2 根充材料葡萄糖渗出量组别葡萄糖浓度 （略）

表3 金黄色葡萄球菌抑菌环直径（略）

表4 变形链球菌抑菌环直径（略）

3 讨论

3.1 细胞毒性研究 纳米羟基磷灰石微结构类似于天然骨基质，可提高材料的生物活性、利用度和生物相容性，可提供适宜的环境促进胶原和矿物的沉积以及成骨细胞的黏附，纳米羟基磷灰石提供了一个更适合骨形成细胞生长的界面从而促进与骨的结合［1］。充填用复方麝香草酚散甲醛甲酚复合制剂封闭剂导致根尖应急炎症反应，这可能是从材料中游离出的酚、醛［2］与组织液接触导致了持续的炎症反应，会在短时间内释放大量的酚和醛:一方面酚通过抑制前列腺紊和白细胞介素的合成使尖周炎症缓解另一方面酚可抑制尖周神经的活性，影响细胞介导的免疫反应，低浓度的酚能激活抑制性T细胞，高浓度的油酚却杀伤该细胞而对尖周组织产生细胞毒作用，但是硬固后毒性降低。 MTT比色法可以准确、快速、灵敏地反映细胞增殖程度和细胞毒性程度［3］，因此MTT比色法用于评价材料细胞毒性的常用实验方法［4］。将细胞增殖度法与细胞的形态学观察相结合，可以更加有效地评价材料的细胞毒性，细胞毒性与被测材料的量尤其是表面积有关［5］。每孔所选用的细胞数量原则上应以避免引起细胞融合为宜［6］。本实验通过吸光度值检测，反映材料对细胞的毒性作用，结果显示，实验组及阴性对照组细胞毒性无显著性差异，实验组与阳性对照有显著差异，说明实验组的细胞毒性小，生物相容性良好，表明实验组符合生物体应用的基本要求，可以进行活体组织的后续实验。

3.2 根管密合度研究 理想的根充材料应当具有优良的封闭性性，能够严密封闭根尖孔。如果封闭性能不良会引起根管充填不严密而造成微渗漏现象，导致根管内的细菌再感染，最终可导致根管治疗失败。20nm羟基磷灰石颗粒，与牙齿硬组织相似，比一般的生物体内的细胞都小，提高了韧性和力学性能，增强了流动性，采用的纳米羟基磷灰石颗粒可以渗透至牙本质深部，而形成较好的封闭性能。对照组可溶解性发生在根管内，根尖充填中对照组的消失使根尖受腐蚀而密合度降低。

3.3 抑菌性研究 根管治疗是当前国内外治疗感染根管的主要方法，遗留在根管系统中的细菌和残余牙髓组织等可能成为根管治疗失败的主要原因。根充糊剂是否具有良好的抑菌作用成为重要因素，患牙根管内以厌氧菌为主的混合菌感染［7］，本实验结果表明，实验组具有较强的抑菌性，碘仿起到了防腐杀菌的主要作用。碘仿是一种良好的消毒剂和防腐剂，具有很强的杀菌和局部抗感染能力，与组织亲和力强，且对组织刺激性小。碘仿遇到组织液或细菌产物时可缓慢分解释放游离碘，与菌体蛋白质的氨基酸结合使其变性，使细菌产生氧化，起到杀菌作用，尤其对厌氧菌的杀灭作用更强，从而有效地消除再感染，碘仿还对吸收根管内渗出物，促进根尖病灶的吸收，减少渗出也有一定的改善作用。纳米材料具有较大的表面积，对细菌具有高吸附力，大量吸附与细菌代谢相关的酶，从而干扰细菌的代谢［8］。羟基磷灰石本身为碱性，不利于细菌生长。对照组发生在根管内的溶解，单独使用充填根管会使根尖再受污染。

4 结论 （1）纳米羟基磷灰石复合根管充填剂有很好的安全性和良好的生物相容性，不会干扰生物细胞的正常功能。（2）纳米羟基磷灰石根充糊剂的根管密合度优于传统的充填用复方麝香草酚散甲醛甲酚复合制剂。（3）纳米羟基磷灰石根充糊剂具有良好的抑菌性。可作为根管充填材料，有良好的应用前景。