纳米复合陶瓷材料的生物相容性研究

【摘要】 目的 通过体内、体外实验，对纳米羟基磷石复合40%二氧化锆材料进行早期生物相容性评价。 方法 按照国家标准GB/T16886医疗器械生物学评价标准的要求，同时报据纳米羟基磷灰石复合40%二氧化锆材料的特定用途，选取样本进行如下生物学实验：致敏试验，溶血试验，刺激试验，肌肉植入试验。 结论 经体内和体外试验结果显示：纳米羟基磷灰石复合40％二氧化锆材料无致敏、无刺激、无变形，具有良好的血液及生物相容性。

【关键词】 纳米羟基磷灰石 二氧化锆 生物相容性

由于创伤、感染、肿瘤以及先天性缺损等原因所致骨缺损在临床十分常见，传统修复骨缺损的方法：如自体骨移植，同种异体骨移植。自体骨取骨量有限，同时取自体骨痛苦大、后遗症多、异体骨又有排异反应。而人工合成的骨移植材料在一定程度上可以达到自体骨和异体骨修复的效果，又可以避免疾病感染和骨源有限等弊端[1]。纳米羟基磷灰石与人体骨骼主要无机成分相似的化学组成和晶体结构，它具有良好的生物相容性，对人体无毒，又能够在植入人体后同骨表面形成很强的化学键结合，有利于骨的长入[2]。然而它的脆性大、韧性较差、容易发生断裂破坏，二氧化锆陶瓷是一种生物惰性陶瓷，具有良好的生物相容性、较高的弯曲强度、断裂韧性和较低的弹性模量。正是由于二氧化锆具有增韧补强的作用，有效的改善纳米羟基磷灰石的力学性能[3]。因此，纳米羟基磷灰石复合40%二氧化锆陶瓷材料，兼具材料生物活性、骨诱导性以及材料力学特性，成为用于承载部位骨缺损修复具有广泛前景的新兴材料。

一、实验方法

(一) 致敏试验

取豚鼠30只，雌雄各半，体重300—500g，随机分为三组，实验组、阴性对照组和阳性对照组各10只。实验样品的生理盐水浸提液，5%甲醛溶液作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照[4]。

（二）刺激试验

选用新西兰白兔，每组3只，雌雄各半随机分3组，体重2.5kg-3.0kg。HA/40% ZrO2浸提液，阴性对照：生理盐水，阳性对照为3%甲醛溶液。在脊柱左侧取一去毛区，标记5个点，常规麻醉消毒用1ml注射器试验组于5个点每点注射0.1ml的浸提液，阴性对照组每点注射0.1ml的生理盐水，阳性对照组每点注射01.ml的甲醛溶液。

（三）溶血实验

穿刺抽取人静脉血10ml加入到含有抗凝肝素钠的试管中，混合抗凝。取抗凝人血8ml，加入10ml生理盐水，稀释备用。取24支干净玻璃试管每组8支。实验组每只试管加入材料浸提液10ml，阴性对照组每只试管加入10ml生理盐水，阳性对照组每只试管加入10ml蒸馏水，将全部试管在37℃恒温箱中恒温30分钟后，每只试管分别加入0.2ml稀释抗凝人血，轻轻混匀，继续保温60分钟后，离心5分钟，吸取上清液至比色皿中，用分光光度计在545nm波长处测定吸光度。

溶血率 =实验材料的吸光度—阴性对照的吸光度/阳性对照的吸光度—阴性对照的吸光度

结果评定：若材料的溶血率<5%，说明该材料符合国家标准；若>5%，则不符合生物医用材料溶血试验要求。

（四）肌肉内植入试验

选用Wister大鼠48只，雌雄各半，体重220±25g，随机分为术后第7、15、30、90天4组， 每组10只。对照组8只。常规麻醉消毒， 分离竖脊肌，于肌肉内植入消毒的HA/40% ZrO2材料块， 缝合肌膜和皮肤。术后每日予以青霉素20 万U 肌注， 连续3 d ， 于术后第7、15、30、90 天取材，对照组手术操作如上， 但不放材料板。大体观察并制作标本切片，HE染色，光镜下观察。

二、结 果

(一)致敏试验

各实验组和生理盐水对照组皮肤均无红斑、水肿或疹块发生，致敏率为0。

但甲醛对照组动物出现显著的红斑和水肿，致敏率为100%，致敏作用强

(二)刺激试验

生理盐水对照组均未见任何刺激反应，试验组3号兔的第2点24h时可见淡红色边界清晰的红斑和边缘明显高于周围皮面的轻度水肿，48h时可见淡红色边界清晰的红斑刚可查出的极轻微的水肿，72h时可见此点极轻微的红斑无水肿。所以24h的平均原发性刺激指数为0.267，48h的平均原发性刺激指数为0.2，而72h的平均原发性刺激指数为0.067，均小于0.4，则说明材料对皮肤无刺激作用，而甲醛对照组各时间点可见严重的红斑和水肿，为强刺激。

(三)溶血试验：

实验组和阴性对照组各管离心后，上层均为清亮无色液体，下层为红细胞沉淀物，该材料的溶血率为3.17%，小于国家标准5%，说明该材料符合组织工程支架溶血试验要求。

经SPSS 10.0统计软件单因素方差分析和SNK-q检验：实验组与阴性对照组之间光吸收度值无统计学差异（P＞0.05），实验组与阳性对照组光吸收度值有显著性差异（P＜0.05）。 (四)肌肉植入试验

将各组实验动物包绕纳米羟基磷灰石-二氧化锆材料的组织切开， 植入后7天，试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应，可见吞噬细胞，无囊壁形成。

植入15天后试样周围有少量嗜中性粒细胞，淋巴细胞浸润和巨细胞反应；试样周围可见小血管与纤维母细胞增生，开始形成疏松囊壁。

植入30天后，试样周围可见少量淋巴细胞，试样周围可见纤维母细胞与胶原纤维，并已形成纤维囊腔结构。

植入90天后试样周围未见或仅见极少量淋巴细胞，纤维化囊壁致密，壁的厚度比形成初期要薄。

三、讨 论

目前，生物医学材料安全性评价主要是采用医疗器械生物学评价体系，即世界标准化组织（ISO）制定的10993系列标准，国内转化为国家标准（GB/T）16886系列标准。参照以上标准，选择了（致敏试验、刺激试验、溶血试验、、肌肉植入试验），由于该生物医学材料在体内是不降解的，作为异物一定会对生物体产生作用，同时生物体也会对植入材料产生排斥反应，如果该材料最终被生物体接受，就认为该生物材料与组织之间相容，被称为具有好的生物相容性；反之，被称为生物不相容。

致敏反应属Ⅳ型变态反应，试验用完全弗氏佐剂和十二烷基硫酸钠石蜡液起到加强致敏作用的效果，又采取了最大剂量法，保证了试验结果的可靠性。况且豚鼠为T淋巴细胞敏感型动物，而结果显示试验组各注射点均无红斑和水肿，证明此材料无致敏反应。

刺激是不涉及免疫学机制的一次、多次或持续与试验组织工程支架材料接触引起的局部炎症反应。本文使用的是皮肤刺激试验。采用5点注射法，各时间点平均原发性刺激指数均小于0.4，则说明材料对皮肤无刺激作用，而甲醛对照组各时间点可见严重的红斑和水肿，为强刺激。

溶血试验是检测生物医用材料对血液红细胞的溶血作用，测定红细胞溶解和血红蛋白游离的程度。本实验采用直接接触法，该材料的溶血率为3.17%，小于国家标准表明该材料不引起溶血反应。此试验对吸光度数值先用单因素方差分析，结果为p〈0.05，说明三组之间存在统计学差异，多组间均数的两两比较采用q检验，结果为试验组与阴性对照组之间p〉0.05，说明与阴性对照组之间无差别，而与阳性对照组之间p〈0.05，说明试验组与阳性对照组之间有显著差别。

体内植入实验是为了评价活体组织与试验样品材料的相互反应。所有医疗器械和材料植入体内均会不同程度地产生组织反应。目前，常采用肌肉局部组织生物学反应评价是根据炎性细胞反应和纤维囊形成进行组织反应分级，然后在根据组织反应分级情况进行结果评定。本试验植入各个时期炎症细胞浸润和纤维囊形成分级符合国家标准。

本实验体内和体外试验结果表明纳米羟基磷灰石复合40%二氧化锆陶瓷材料是一种无致敏、无刺激、无溶血，具有良好的血液和组织相容性的材料，又因其材料本身具有良好的生物活性及力学特性，有望成为修复骨缺损十分重要的生物材料。

参 考 文 献

[1] MuruganR，RamakrishnaS.Development of nanocomposites for bonegrafting.Compos.Sci.Technol.，2005，65(15-16):2385-2406.

[2] 胡江.组织工程研究进展.2000.生物医学工程学杂志，17(1):75-79

[3] 李世普.《生物医学材料导论》，武汉工业大学出版社，2000.

[4] 郝和平.医疗器械生物学评价标准实施指南[M].北京:中国标准出版社，2002.81～135.