纳米羟基磷灰石-40%二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性评价

作者：李超陶树清周长林逯代峰荣杰生

【摘要】 ［目的］评估纳米羟基磷灰石-二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性。［方法］根据ISO10993-1标准，采用细胞毒性试验、急性毒性试验、溶血试验和体内植入(90 d)试验对纳米羟基磷灰石-二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性进行评估。［结果］纳米羟基磷灰石-二氧化锆生物陶瓷材料组织相容性的细胞毒性评分小于I级，细胞生长无明显抑制现象，无急性毒性反应，无溶血反应，体内植入符合植入材料生物学评价要求。［结论］纳米羟基磷灰石-二氧化锆生物陶瓷材料具有良好的组织相容性，作为骨组织工程中生物支架材料具有广阔临床应用前景。

【关键词】 羟基磷灰石二氧化锆组织相容性 Abstract: ［Objective］To evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite-zirconia composite bioceramic. ［Methods］According to the standard of ISO 10993-1，cytotoxicity experiment，acute toxicity test，hemolysis test and in vivo implantation(90 days) test were conducted to evaluate the histocompatibility of nano hydroxyapatite-zirconia composite bioceramic.［Results］The score of cytotoxicity experiment was lower than grade I，and there was no significant inhibition of cell growth，no acute toxic reaction or hemolytic reaction.And the in vivo implantation met the requirements of the biological evaluation of implant materials.［Conclusion］Nano hydroxyzpatie-zirconia composite bioceramic showed a good histocompatibility.It has a broad prospect as a biomaterial scaffold in the bone tissue engineering.

Key words：hydroxyapatite; zirconia; histocompatibility 生物陶瓷是目前骨组织工程常用的支架材料，传统的生物陶瓷材料由于粒径较大，气孔大，其脆性及弹性模量较大，影响了在生物医学领域的应用［1］。由哈尔滨工业大学材料学院与哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科共同研究制备的纳米羟基磷灰石-40%二氧化锆(nano hydroxyapatite-40%zirconia，nano HA-40%ZrO2)陶瓷材料强度、硬度、韧性和超塑性上都得到提高，如在人工器官制造，临床应用等方面将比传统陶瓷有更广泛的应用并具有极大的发展前景。本研究选用细胞毒性试验、急性毒性试验、溶血试验，植入实验评价纳米HA-40%ZrO2组织相容性，初步评价该材料应用于临床医学的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料的制备与浸提液提取

HA／40%ZrO2、HA由哈尔滨工业大学材料学院与哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科共同研究制备，用溶胶-凝胶(sol-gel)法制成纳米羟墓磷灰石粉粒(HA)［2］，然后将质量比按60%纳米HA+40%二氧化锆比例配制，纳米HA和二氧化锆粉体经充分研磨后得到纳米羟基磷灰石／二氧化锆复合粉体，采用热压低温烧结技术磨削制成3 mm×3 mm×5 mm长方体。将经过环氧乙烷灭菌的上述复合材料以1 g材料／5 ml介质的比例，放入生理盐水或小牛血中，37℃恒温箱中静置浸提72 h制备成HA／40%ZrO2浸提液，过滤除菌，4℃冰箱保存备用。

1.2 细胞毒性试验

1.2.1 实验方法

采用L929细胞(哈尔滨医科大学遗传实验室馈赠)经复苏、传代后，将细胞培养基配制1×104个／ml细胞悬液分注于96孔塑料培养皿中，每孔100 μl，每组每观察期至少8孔，细胞培养箱内培养24 h。然后弃去原培养基，用PBS洗涤2次，试验组加入100 μl小牛血清浸提液，阴性对照组加入100 μl小牛血清，阳性对照组加入64 g/L苯酚溶液，继续培养1、2 d和3 d。弃去培养皿中的浸提液和培养基，加入20 μl/孔的MTT液，继续培养6 h，吸去原液，加入150 μl／孔二甲亚砜，振荡10 min，在BECKMAN DU640紫外分光光度计以500 nm波长测定吸光度OD值，并计算细胞的相对增殖度(RGR)。RGR=(试验组OD值-空白OD值)／(阴性对照组OD值-空白OD值)

1.2.2 细胞毒性分级与判定

RGR≥100%评为0级；RGR在75%～99%之间评为I级；RGR在50%～74%之间评为II级；RGR在25%～49%之间评为Ⅲ级；RGR在1%～24%之间评为Ⅳ级；RGR为0时评为V级)。实验结果为1或0级反应为合格，实验结果为Ⅱ级反应时需结合细胞形态综合评价，实验结果为Ⅲ～V级反应为不合格。

1.3 急性全身毒性试验

1.3.1 动物分组及实验方法

将20只昆明小鼠(哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供)，雌雄各半，体重（20±2.0） g，随机均分为实验组和对照组，实验组用生理盐水HA／40%ZrO2材料浸提液，对照组用生理盐水，均以50 ml／kg剂量通过小鼠腹腔注射，观察注射后24、48和72 h动物的一般状态、毒性表现。

1.3.2 结果评定

72 h内实验组反应小于对照组为符合要求；实验组中40%死亡，或60%出现明显毒性反应，或动物普遍出现进行性体重下降为不符合要求。

1.4 溶血试验

1.4.1 制备新鲜稀释血

经肘前静脉抽取健康人(8人，男性)静脉血4 ml，混入3.2%柠檬酸钠缓冲剂0.4 ml，加入生理盐水5 ml进行稀释即制备出新鲜稀释血。

1.4.2 实验分组及方法

实验组取HA／40%ZrO2浸提液10 ml，阴性对照组取9 g/L生理盐水10 ml，阳性对照组取蒸馏水10 ml，每组各取8个试管，将所有试管放入37℃恒温箱中水浴30 min，各试管内分别加入新鲜稀释血0.2 ml轻摇，37℃恒温保留60 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液在紫外分光光度仪上测定545 nm处的光吸收度(A)。溶血率计算公式：溶血率=(实验组吸光度-阴性对照组吸光度)／(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)×100%

1.4.3 结果评定

溶血率<5%为合格；溶血率≥5%为不合格

1.5 肌肉内种植实验

1.5.1 实验分组及方法

选用Wister大鼠40只(哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供)，雌雄各半，体重（220±25） g，随机分为术后第7、15、30、90 d 4组，每组10只。将HA-40%ZrO2材料块环氧乙烷消毒后备用。常规麻醉消毒，在大鼠脊柱右侧1.0 cm处做切口，分离竖脊肌，于肌肉内植入HA／40%ZrO2材料块，缝合肌膜和皮肤。术后每日予以青霉素20万U肌注，连续3 d，于术后第7、15、30、90 d取材。

1.5.2 观察指标

大体观察：观察术后大鼠饮食、活动、切口反应；肉眼下观察有无材料外露，材料表面的包膜形成情况、有无红肿等。病理学观察：术后各时相点连同材料、包膜和样品周围0.5～1.0 cm厚的肌肉共同取出，常规HE染色，每个标本取3张切片。在光学显微镜下观察材料周围包膜形成情况和组织反应情况。

1.6 统计学处理

应用SPSS 11.0统计软件对实验数据进行统计分析，计量资料两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 细胞毒性试验

HA／40%ZrO2试验组及阴性对照组，随着培养时间延长，OD值均有增加，阳性组OD值无增加，空白组OD值为0.041。实验组与阴性对照组同一时间组间比较差异无显著性(P>0.05)，与阳性对照组比较差异有显著性(P<0.01)。HA／40%ZrO2小牛血清浸提液对L929细胞的细胞毒性均为1级(表1)，符合国家医用生物材料细胞毒性要求［2］。

2.2 急性全身毒性实验

实验小鼠均无死亡、进食正常，无惊厥、呼吸抑制、腹泻、运动减少和体重下降等不良反应，评价属无毒级。组间小鼠体重增加量比较差异无显著性(P>0.05)，小鼠体重增加量见表2。表1 细胞毒性实验各组OD值，RGR和细胞毒性分级分组培养24 hOD值RGR（略）

2.3 溶血实验

HA／40%ZrO2浸提液组吸光度为0.040±0.003，阴性对照组吸光度为0.009±0.001，阳性对照组吸光度为0.988±0.031，根据溶血率公式计算HA-40%ZrO2材料浸提液的溶血率为3.17%，溶血率<5%，符合溶血实验要求。

2.4 肌肉内植入实验

2.4.1 大体观察

各组实验动物术后当天开始进食且活动正常，创口无明显出血、渗出，术后5 d创口愈合良好。未见皮肤破溃、植入物外露等现象。将包绕HA-40%ZrO2材料的组织切开，术后第7、15 d时无明显包膜形成，第30、90 d时可见包膜组织，包膜随时间延长逐渐变薄。表2 急性全身毒性实验体重变化情况（略）

2.4.2 组织病理学检查 材料植入大鼠竖脊肌植入后7 d，试样周围可见以嗜中性粒细胞浸润为主的炎性反应，可见吞噬细胞，无囊壁形成（图1）；植入15 d后试样周围有少量嗜中性粒细胞、淋巴细胞浸润和巨细胞；试样周围可见小血管与纤维母细胞增生，开始形成疏松囊壁（图2）；植入30 d后，试样周围可见少量淋巴细胞，试样周围可见纤维母细胞与胶原纤维，并已形成纤维囊腔结构（图3）；植入90 d后试样周围未见或仅见极少量淋巴细胞，纤维化囊壁致密，壁的厚度比形成初期要薄（图4）。

3 讨论 生物陶瓷是目前骨组织工程常用的支架材料，常用的是以羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)粉料为原料［2］，经高温烧结即得到的生物羟基磷灰石陶瓷，由于其粒径较大，气孔大，其脆性及弹性模量较大，影响了在生物医学领域的应用［3］。纳米生物复合材料是将纳米微粒与其他材料复合制成各种复合材料从而获得许多优良特征［4］。氧化锆(ZrO2)具有良好的耐磨性、抗生理腐蚀性和好的生物相容性，而且其强度、断裂韧性指标也高于其他所有的生物陶瓷材料，作为第二相颗粒加入到HA涂层中可以显著提高涂层材料的力学性能 ［5］。目前国内外已制备出含有(10%～70%)ZrO2的纳米羟基磷灰石复合材料［6］，其强度和韧性等综合性能可达到甚至超过致密骨骼的相应性能［7、8］。其ZrO2含量越高其力学性能提高越明显，但由于金属离子效应，吸附在材料表面的组织生物分子的化学组成将会发生相应的变化。为探索在力学性能和组织相容性上达到平衡，由哈尔滨工业大学材料学院与哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科共同研究制备成HA／40%ZrO2，其在强度、硬度和韧性上都得到显著提高。

当生物材料植入人体后，材料周围组织(组织细胞，水，离子和生物分子及其他物质的体液)的组成是非常复杂的，表现的形式也多种多样。组织相容性是指材料与活体组织之间相互容纳的程度，即材料的植入或接触对组织的组成，形态结构和功能的影响［9］。目前，人们对生物材料与骨的相容性研究主要包括三部分：(1)用体外细胞培养法研究其细胞相容性；(2)用体内种植实验研究其组织相容性；(3)临床研究其组织相容性。

本实验测定HAp2ZrO2复合陶瓷的生物学性能首先采用体外细胞毒性实验，选用的四唑盐(MMT)法是一种国际标准检测细胞存活和生长的方法，其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物(Formazan)并沉积在活细胞中，而死亡细胞对MTT不起作用，因此死亡细胞不会被染色。由于MTT结晶物形成量与细胞数呈正比，OD值就能间接反映活细胞数量。通过计算出不同浓度试验材料浸提液作用下的细胞增殖度，可以对该材料的细胞毒性作用作出可靠的定量评价。结果显示24 h、48 h后的各组HA／40%ZrO浸提液细胞毒性分级均为0级，72 h后的各组HA／40%ZrO2浸提液细胞毒性分级0或1级别，且与阴性对照组相比无明显差异，由此说明HA／40%ZrO2无细胞毒性作用。

体内植入试验可从宏观和微观水平来评价组织工程支架材料对组织的局部反应，包括早期的炎症反应和随后的纤维增生反应。通过体内植入试验结果可见，材料在大鼠肌肉内埋植后，均未出现任何坏死、纤维化、异位骨化和囊性改变。镜下可见在早期(7 d)出现以嗜中性粒细胞浸润为主的急性非特异性炎症反应，多由于手术创伤、继发性微生物侵入引起的细菌性炎症或者植入物抑制局部的免疫应答能力而产生急性炎症反应。植入15 d后，材料周围嗜中性粒细胞减少，可见淋巴细胞、巨细胞，转入慢性无菌性炎症表现，并可见纤维母细胞与胶原纤维，开始形成疏松囊壁。植入30 d后，炎症反应明显减轻并伴有纤维增生反应，植入90 d后，炎症反应基本消失，纤维化囊壁致密且较初期薄。说明材料对正常组织已无刺激作用。符合植入物正常病理变化及评定标准［10］，说明HA／40%ZrO2与周围组织有良好的相容性。

在临床方面研究其组织相容性，采用的全身急性毒性试验和溶血试验，根据结果提示由于HA和ZrO2为惰性材料，其在生物体内化学性质稳定，无组成元素溶出，因此不会因材料可溶性残余分子的化学作用导致生物体急性反应及溶血作用，说明HA／40%ZrO2无全身急性毒性及溶血反应。 本实验表明纳米羟基磷灰石-40%二氧化锆生物陶瓷材料具有良好的组织相容性，考虑到其力学性质的优越性，其作为骨组织工程增韧材料、关节和口腔修复材料具有广阔的临床应用前景。在临床应用之前，该纳米生物材料还需进一步研究遗传毒性及长期植入试验，观察长期植入生物体内后复合材料的化学、力学稳定性及材料微小颗粒溶解情况，为临床应用奠定基础。