加急见刊

细胞培养法评价生物材料生物相容性研究进展

未知  2006-10-10

细胞培养法检测材料生物相容性是一种快速、简便、重复性好又价廉的方法,在材料生物相容性评价中起着越来越重要的作用。由于新材料不断涌现、材料植入体内的部位及使用目的日趋繁杂、材料毒性作用的强弱以及与机体反应的复杂性等因素决定了细胞毒性试验中实验方法及实验细胞的多样性。根据生物材料本身的理化特性、植入体内的部位及使用目的选择适当的实验方法和实验细胞至关重要。以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量的变化,近几年来研究材料对细胞生长、附着、增殖及代谢方面影响的报道日趋增多,并提出了以有活力的细胞数和细胞生长作为材料生物相容性评价标准的观点。通过结合免疫、化学、放射及影像学等多学科的技术发展,使人们进一步深入了解细胞结构和功能的变化关系,进而阐明材料对细胞的作用机制,是今后细胞培养法评价材料生物相容性的发展方向。

Abstract It is quick convient good-repeating and cheap that examining the biotic materials compatibility through cell-culturing method,and it is more and more important in evaluating the compatibility of biotic material.The new material appeating continously complicating of the part and aim material be planted in the intensity of materials toxic effect the reactions complication of material and biotic body,all of these decide the variety of experiment method and cells in cell toxicity experiment.It is very important that choices the right experiment method and cells according to the materials character the part and aim the material be planted in .The evaluation of biotic materials compatibility stressed on the changing of cells form and quantity before.Inrecent years,more and more reports appear about material influeances the growth.adhesion proliferation and metabolizing of cell.and presents the point that the evaluation standard of biotic materials compatibility should be set according to the active cells quantity and their growth.Combining many subjects technological development,such as immunology, chemistry,radiation and shadowgraphy,thoroughly inquires the changeing relation of cells structure and funtion,furtherly clarifes the materials effect on cell,It is the developing direction in the future that evaluates the biotic materials compatibility in cedd-culturing method.

Key words Biotic material Cell-culturing Compatibility Toxicity experiment

生物材料的临床应用已有较长的历史,广泛应用于牙科、眼科、整形外科及心血管外科领域。目前美每年有2-3百万人工脏器或假肢植入人体中。生物材料不仅要具有临床使用时所需要的理化性能,还必须具有良好的生物相容性,以保证使用安全。如何快速准确地评价材料的生物相容性,对于研制新材料和缩短研究周期起着重要的作用[1]。

根据1982年美国国家标准学会和牙科协会(ANSI/ADA)公布的评价生物相容性实验标准草案,评价生物相容性的实验方法有全身毒性试验(口服法)、急性全身毒性试验(静脉注射法)、吸入毒性试验、溶血试验、皮下植入试验、骨内植入试验、过敏试验等[2]。细胞培养法作为检测材料毒性的手段(亦称为细胞毒性试验),具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点,正日益受到人们的广泛重视。本文就该研究领域近几年的发展及动向作一简介。

1 细胞毒性试验方法的进展

1948年Rosen Bluth等首次报道利用鼠成纤维细胞培养来筛选聚合物,开始了细胞毒性试验评价生物材料的生物相容性的研究与应用工作,迄今为止这方面已有大量的工作积累与研究发现。细胞毒性试验在评价材料生物相容性地位已得到公认[3]。由于目前对生物相容性概念及机理还完全了解,加之材料的多样性、置入要体内环境中的变异性、材料与机体作用的复杂性等因素,故迄今为止,国内外还没有一个统一细胞毒性试验方法。

细胞毒性试验由于细胞培养方式(如单层细胞培养、细胞悬液与材料混合培养、细胞在材料上培养等)的不同,细胞与材料之间有无间质(即细胞直接与材料或其浸出液接触,还是通过间质接触)以及材料毒性成份(即材料本身、浸出物、扩散物或材料降解产物等)不同决定了细胞毒性试验方法的多样性。根据细胞和材料之间有无间质可以将细胞毒性试验方法分为间接法与直接法两大类。

1.1间接法

最典型的间接法是琼脂覆盖法,该法是Dubecco在1952年首先提出[4]。其方法是将含有培养液的琼层平铺在有单层细胞的培养皿中,再在固化的琼脂层上放上试样进行细胞培养。此法优点是不管试验材料是什么形态(膜、粉末或油脂状)等都适用。但该法敏感性受试样溶出物琼脂层上扩散程度的影响。当溶出物分子量小,易溶于水,其毒性发现早且较强。反之即使有毒的材料,如溶出物分子量大并难溶于水,使用该法时材料毒性就难以表现出来。

为克服琼脂法的缺点,Sabita Sriva等提出分子滤过法[3]。该法是在单层细胞上覆盖一层丙烯盐制成的微孔滤膜,将试样材料放在滤膜上,使材料毒性在成份通过滤膜作用于其下的细胞。由于滤膜微孔直径约0.45μm,Bondemark认为该法适合评价毒性成份分子量小的材料的相容性[5]。 van Luyn等1992年报道用甲基纤维素细胞培养法评价聚合物的细胞毒性[6]。该法是在甲基纤维素中混入细胞表面进行培养。该法优点是生物材料的水解及细胞坏死释放出的蛋白分解酶引起的酶解作用均要发生,因此可同观察到生物材料的原发性及继发性细胞毒性。

1.2 直接法

生物材料中一些易溶出物质引起炎症反应和组织反应的主要原因。易溶出物质一般是原料单体、低分子聚合物、催化剂、溶剂、稳定剂、乳化剂等。为研究这些溶出物的细胞毒性,一些学者提出浸出液法。该法是将试样投入培养液或蒸馏水中适当条件下进行浸泡,制备出含有溶出的浸泡液再将浸了液加在含有细胞的培养皿或试管中继续培养,观察溶出物对细胞的影响。Oshima认为不同浸提条件和浸提方式所制备的材料溶出物在细胞敏感程度上并无显著性差异[7]。

直接浸渍法:该法是形态不规则的试样(如金属粉末、油脂类材料)等与细胞一起放入培养皿中进行培养。当有溶出物时试样周围的细胞就会受到影响。宁淑华等1988年用该法对医用硅胶及聚乙烯醇进行细胞毒性试验[8]。作者认为对于形态不规则有微量毒性的材料使用该法较为适宜。

另一些学者在直接法基础上提出直接接触法。该法将细胞直接放在生物材料上进行细胞培养。当有毒性物质释放时,由细胞形态变化和数量增减检测细胞毒性程度,同时可以直接观察到细胞在材料表面贴附情况。直接接触法不仅能直接检测材料溶出物的细胞毒性,同时也是考察材料与组织细胞相容性的重要手段。通常“材料生物相容性好”,很多场合都是指细胞容易贴壁且能迅速繁殖生长。因此可根据直接接触法细胞培养的结果推测材料植入人体后与机体细胞的反应。但是,对于与血液接触的循环系统来说,为了避免引起血栓形成,就希望细胞难以贴壁且不易增殖。因此应根据材料的使用目的,作出相应的生物相容性判断。

Tsuchiya[9]等于1994年对琼脂法、分子滤过法、浸出液和直接接触法对材料的细胞毒性敏感程度的差异性进行比较。作者认为浸出液法适合检测材料溶出物毒性,并与动物毒性试验结果相符合。直接接触法对材料的细胞毒性敏感性最高,可测出材料微弱的细胞毒性。琼脂法适合对毒性大的大指材料进行筛选。分子滤过法适合毒性成份分子子量小的材料进行生物相容性评价。

综上所述。细胞毒性试验方法多种多样,并各有其特色。每种试验方法因其原理及方法不同,选择材料的针对性也不同。根据实验材料本身理化性质、毒性成份表现形式、毒性作用强弱及材料用途选择正确的实验方法是至关重要的。

2 实验细胞研究进展

目前细胞毒性试验中应用最早的及使用最广泛的细胞是L-929细胞,该细胞是Earle等1948年从小鼠皮小组织中分离出的成纤维细胞。另一种应用较多的细胞是Gey等1953年从人类子宫肿瘤中分离出的子宫粘膜上细胞(HeLa细胞)[10]。由于这两种具有传代容易,繁殖迅速、体外培养条件低、易储存,同时这两种已建立成系的细胞株能为实验提供稳定传代的细胞,能为许多材料细胞毒性评价所共用等优点。1982年美国质量标准协会将L-929细胞和HaLe细胞推荐为细胞毒性试验中的标准细胞[2]。

由于L-929细胞来源于小鼠的皮下组织,HaLe细胞来源于人的肿瘤组织。这两种已建立成系的细胞株都具有无限分裂增殖类似肿瘤细胞的特征。因此人们对利用这现两种细胞代替人体正常组织细胞评价材料的生物相容性的敏感性及可靠性产生了疑问。同时随着不断涌现,人们对材料植入人体后与机体组织之间可能发生的反应其对材料的影响产生了浓厚的兴趣。因此单用L0929和HaLe细胞培养检测材料的生物相容性已不能满足人们的这种需要。

从九十年代起越来越多学者根据材料植入体内的不同部位及使用目的选择人体不部位或/和组织来源的细胞作业实验细胞,使体外细胞培养对机体内环境的模拟更趋真实,其结果更为准确与客观。

对宿主而言植入宿主体内的生物材料是种异物,因此材料植入体内最普遍和最常见的反应是免疫排斥反应。由于单核巨噬细胞来源于人体的血液,在人体免疫系统中起着重要的作用,能释放各种刺激因子激活补体引起急慢性炎症反应,同时刺激成纤维细胞生长促进伤品的愈合。因此选择单核巨噬细胞作评价材料细胞毒性的实验细胞,有助于人们了解材料置入体内引起的炎症反应对组织细胞的影响[1]。

Cheung认为不同组织来源的细胞材料的敏感性是有差异的[12]。只用软组织来源的细胞培养检测材料的细胞毒性尚不能全面反映出材料的生物相容性。以骨替代材料和牙用材料为例。前者种植到骨组织内,所接触的是骨环境,而后者存在于软组织环境中。因此骨替代材料应选择骨组织来源的细胞,因为这种细胞在体外培养中可形成体内环境一致的矿物化小结,这种小结内含有类成骨细胞和类骨髓细胞及钙化的胶原基质,使体外细胞包培养更好地模拟了生物材料与骨组织在体内的反应。牙用材料可释放一些可溶性的毒性成份如Na+、Ca2+、Al3+和氟化物等[]14,这些可溶物质主要影响邻近的牙组织及口腔粘膜的上皮细胞、成纤维细胞及各种免疫细胞,并对这些细胞的生长、附着增殖及代谢等功能产生影响。因此对牙材料采用口腔粘膜的成纤细胞或/和上皮细胞才能更准确地反映出材料的生物相容性。

3 细胞毒性的观察方法

以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量,通过细胞形态的改变和数量的增减判断材料的细胞毒性[15]。由于材料毒性成份对细胞的损伤,首先发生细胞生物化学反应和生物分子结构的改变,出现代谢和机能的改变如线粒体氧化代谢障碍、蛋白质合成下降,细胞膜选择性通透屏障作用消失等,这种变化用形态学方法通常不能发现。只有当细胞死亡10h以上,细胞的自溶性变化相当明显的才能在光显微镜下根据细胞死亡的判断特点,即核浓缩、核碎裂、胞浆伊红染色等判断材料的细胞毒性程度。因此传统的细胞毒性观察方法不能及时、准确地判断材料的细胞毒性。

九十年代以来,越来越多学者倾向于从材料毒性成份引起细胞死亡所产生的细胞形态和数量的变化评价材料生物相容性转移到材料对细胞的生长、附着、增殖及代谢功能的影响,并提出了以存活的有功能的细胞或/和细胞生长增殖情况作材料的生物相容性评价指标。

在体外细胞培养中已有学者提出一些能敏感地反映细胞活力功/和细胞殖的实验室评价方法。如放射性位素(3H-胸腺嘧啶,3H-亮氨酸等)摄入法[16]、荧光染色法(如乙酰乙酸荧光素)[18]、流式细胞光度术等[19]。这此方法各有其优缺点及适用范围。

放射性同位素摄入法是在培养基中掺入3H-胸腺嘧啶或/和3H-亮氨酸等,根据3H-胸腺嘧啶在细胞内含量测量DNA的合成含量,3H-亮氨酸含量测定细胞内蛋白质合成清况[16]。该法能揭示细胞分子水平的动态变化,是研究细胞代谢状态的重要手段。但同位素物质对研究人员会造成一定程度的放射性损害,同时需要特殊设计的实验室和一些特殊设备是其缺点。

四甲基偶氮唑盐微量酶反应色法(MTT法)是由Mosroann在1983年提出,最初应用于免疫学领域,近年一些学者将该法应用到生物相容性评价中[20]。其原理是线粒体琥珀酸脱氢酶能催化四甲基偶氮唑盐(MTT)形成兰色甲替。形成数目的多寡与活细胞数目和功能状态呈正相关,该法简便迅速、不接触同位素、而敏感性同位素法接近。该法缺点是甲替有时易聚集成团影响结果的难确性。

荧光染色法:其基本原理是当细胞受到损伤时,细胞膜的选择通透性屏障作用消失,利用乙酰乙酸荧光素和溴化乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在荧光显微镜下迅速区分受损细胞[22]该法特点适合评价首先影响细胞膜功能的材料的生理相容性。

流式细胞光度术(Flow cytometry,FCM)是近几年迅速发展起来的分析细胞的方法[22]。该法利用鞘流原理,使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列,按重力方向流动。细胞被激光照射后反射荧光,检测器械可逐个结细胞的荧光强度进行测定。FCM对细胞测定能力30-60万个细胞/分钟,同时可对细胞的核酸,蛋白质、酶、细胞周期分布等八种量进行测定。该法在材料的生物相容性评价中有着广泛的应用价值。

4 结束语

细胞培养法检测材料生物相容性是一种快速、简便、重复性好又价廉的方法,在材料生物相容性评价中起着越来越重要的作用。由于新材料不断涌现、材料植入体内的部位及使用目的止趋繁杂、材料毒性作用的强弱以及材料与机体反应的复杂性等因素,决定了细胞毒性试验中实验方法及实验细胞的多样性。根据生物材料本峰的理化特性、植入体内的部位及使用目的选择适当的实验方法和细胞至关重要。以往对材料生物相容性的评价往往着眼于细胞的形态与数量变化,近几年来研究材料对细胞生长、附着、增殖及代谢方面影响的报道日趋增多,并提出了以有活力的细胞数或/和细胞生长作为材料生物相容性评价标准的观点。通过结合免疫、化学、放射及影像学等多学科的技术发展,使人们进一步深入了解细胞和功能变化关系,进而阐明材料对细胞的作用机制,是今后细胞培养法评价材料生物相容性的发展方向。

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