失水山梨醇脂肪酸酯聚乙二醇嫁接的聚乙烯醇化磁性药物载体的制备及应用

【摘要】 通过丁二酸酐将失水山梨醇脂肪酸酯(Span80)和聚乙二醇(PEG400)联接在一起，合成了一种新的非离子表面活性剂。然后将其嫁接在聚乙烯醇(PVA)化的Fe3O4磁性粒子上，合成了一种新型靶向药物载体。这种载体兼备了Span80/PEG400类脂囊泡和磁性材料的特点，具有良好的稳定性和靶向作用。将这种新型载体用于两性霉素的包封，包封率可达96.6%，且方法简便。实验过程中采用了FTIR， NMR， XRD和TEM等多种手段进行表征。

【关键词】 失水山梨醇脂肪酸酯; 聚乙二醇; 聚乙烯醇; 药物载体; 磁性粒子

1 引 言

纳米微粒四氧化三铁是一种磁性强、制备相对简单且生物相容性较好的磁性粒子，是生物医学领域常采用的磁性载体材料[1]。将有机高分子和这种磁性物质结合后会形成具有一定磁相应性及特殊结构的微球，其既可以通过共价键来结合酶[2，3]、细胞[4]等生物活性物质，或作为药物的载体[5]和固相吸附材料[6～8]等;又可对外加磁场表现出强烈的磁相应性。目前，用于磁性材料的有机高分子主要有壳聚糖[9]、血清白蛋白[10]等。而用非离子表面活性剂改性的磁性材料少有报道[11]。

失水山梨醇脂肪酸酯(Span80)和聚乙二醇(PEG400)复配形成的类脂囊泡可作为药物助剂，长期稳定存在[12]。本实验合成了Span80PEG400，将其成功地嫁接在磁性粒子上。将聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol， PVA)羧基化(PVAc)，然后将PVAc涂层在磁性粒子表面，制备出一种新型的靶向药物载体，并将此载体用于两性霉素的包封，效果良好。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

EQUINX55傅立叶变换红外光谱仪(德国Bruker公司);UitraShied 300M核磁共振谱仪(瑞士Bruker公司);XPERTPRO X射线衍射仪(荷兰飞利浦公司); TU1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司);H800透射电子显微镜(日本Hitachi公司)。

聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯(Tween 20)、Span80、PEG400、PVA和丁二酸酐为分析纯试剂;4二甲氨基吡啶(4DMAP， 99%)，N，N′二环己基碳二亚胺(DCC， 99%)购于上海 Medpep公司;其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

2.2 磁性微球的制备

2.2.1 Span80PEG400的合成 取干燥圆底烧瓶，加入反应溶剂二氯甲烷(CH2Cl2) 200 mL，Span80 21.4 g (0.05 mol)，丁二酸酐(Succinic anhydride)15 g(15 mol)，及催化剂4DMAP 6.1 g (0.05 mol)，于65 ℃水浴搅拌下反应12 h。冷却后抽滤除去未反应的丁二酸酐，旋转蒸发滤液除去CH2Cl2后得Span80的酯化产物。在200 mL CH2Cl2中，按照摩尔比1∶1∶1∶1分别加入PEG400、Span80的酯化物、DCC及催化剂4DMAP，室温下磁力搅拌24 h。反应结束后抽滤除去DCC，滤液旋转蒸发，然后加几滴四氢呋喃于冰箱中保存过夜。

2.2.2 Span80PEG400嫁接的PVA化磁性粒子制备 称取适量Span80PEG400倒入三口烧瓶中，加50 mL甲苯为脱水剂，搅拌溶解后，加入适量Fe3O4PVAc，再加入少量H2SO4作催化剂，加热回流反应3 h后停止。弃去甲苯液，用无水乙醇洗脱粘附在烧瓶壁上的黑色产物，用乙醇冲洗多次后蒸去乙醇，产物置于50 ℃真空干燥后备用。

2.3 新型靶向制剂作为两性霉素的载体

将Fe3O4PVAcSpan80PEG400和水或者一定浓度的两性霉素(AmB)的药物溶液按照质量比1∶99配制，超声15 min后[12]，各取1.00 mL装于透析袋中，在25 mL水中透析24 h，测定AmB在407.0 nm处的吸光度，扣除空白的吸收，由工作曲线确定游离药物的浓度，根据EE(%)=(c总-c游离)/c总×100计算包封率[10]。

3 结果与讨论

3.1 磁性靶向载体的合成及表征

3.1.1 Fe3O4PVAc微球的合成及表征 参照文献[13] 合成了Fe3O4PVAc磁性微球。对比红外差谱可知，Fe3O4PVAc即具有FeO在570 cm-1左右的特征吸收峰，又含有1617 cm-1的羰基吸收峰和1049 cm-1处的醚键的吸收峰， 其结果与文献[13]相符。此外，在13CNMR中，δ 163.23×10-6的峰确定为PVAc的羰基所致。由此可知，PVAc已成功嫁接在Fe3O4粒子表面。

采用透射电子显微镜(TEM)观察Fe3O4纳米粒子及Fe3O4PVAc的微观形态。由图1A可见，共沉淀法制备得到的Fe3O4纳米粒子主要为球形结构，粒子大小均匀。粒子的直径约20 nm。其表面包覆后形成的Fe3O4PVAc的形貌见图1B。包覆后的团聚现象减弱，有部分分散的趋势。

Fe3O4在XRD图谱中有6个特征衍射峰(220， 311， 400， 422， 511和440)，这些指标参数在图2中的两个谱线里都能观察到，说明合成的Fe3O4纳米微粒具有尖晶石结构，且在表面包覆时无相变现象。

3.1.2 Span80PEG400嫁接的磁性微球的制备及表征 Span80PEG400的合成分为两步，均为酯化反应，其反应原理如下:

由A和B的分子结构可知，B结构式上多了一个双羰基(丁二酸酐打开所致)。而反映在FTIR光谱上(未列出)，就是在1740和1850 cm-1之间有双峰(OCOCH2CH2COOH)。此外，采用1H NMR(CDCl3)对所得产物B的化学结构进行表征，其中，与羰基相连的两个亚甲基(OCOCH2CH2COOH)的化学位移出现在δ 2.61处，与文献[13]报道的结果一致，证实了B的存在。产物C的红外谱图与B相比，多了1109 cm-1处的νas(COC)和952 cm-1处的νs(COC)。此外，在Span80PEG400的1HNMR(CDCl3)谱图上(未列出)， δ 4.21处出现的亚甲基源于PEG400，且与琥珀酰基(Succinyl group)相连，而δ 3.56处的峰则为PEG400分子结构中的重复单元。证实了通过丁二酸酐Span80已成功连接上PEG400。在靶向制剂Fe3O4PVAcSpan80PEG400的红外图谱中， FeO键(570 cm-1)，羰基(1680 cm-1)，特别是醚键的(1100～1200 cm-1)峰明显增强，由此可知已成功制备了改性的磁性微球。

3.2 新型靶向制剂包封两性霉素及结果分析

两性霉素是治疗深部真菌感染的首选药物之一，但该药物具有严重毒性，使临床应用受到很大限制。由此，对这类药物的包封和控制释放是提高疗效、降低毒副作用最有效的方法。按照2.3节所述方法，用Fe3O4PVAcSpan80PEG400作为两性霉素药物的载体进行实验，为了解其包封效果，需建立在此体系下两性霉素药物的检测方法。由于是磁性载体，在磁场作用下，很容易实现载体与未包封药物的分离和测定。

3.2.1 脂质体的吸收光谱和标准曲线 以无水乙醇为溶剂配制较低浓度的两性霉素溶液，以无水乙醇为参比，紫外可见分光光度计在300～700 nm内扫描，在407 nm处出现最大吸收。而空白脂质体和包封药物的脂质体的紫外吸收光谱表明，在407 nm处测定时，空白脂质体几乎无吸收，故不影响药物的测定(见图3)。 图3 脂质体和空白脂质体的紫外吸收光谱图

配制浓度分别为0.5， 1.0， 2.0， 3.0和4.0 mg/L的两性霉素标准溶液，在407 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归得标准曲线。测定两性霉素的线性回归方程为：A=-0.3818+0.08866c(r=0.99883， n=5)。

3.2.2 两性霉素的包封及误差分析 当Fe3O4PVAcSpan80PEG400和0.25 g/L两性霉素(AmB)的药物溶液按照不同质量体积比配制时，包封率见表1。随着质量体积比的增加， 包封率也在逐渐增大;但质量体积比达到一定值后再增大，包封率变化不大，最大包封率为96.6%，高于Span80和PEG400制备的囊泡[12]的包封率95.2%。但由于其具有磁铁靶向性，结果令人满意。需要说明的是，由于这种新型磁性粒子具有两性分子的特点，可用于磁性囊泡等的自组装[15]和作为分离富集的载体等，相关的工作有待于进一步的研究。 表1 在不同质量体积比条件下AmB药物在Fe3O4PVAcSpan80PEG400中的包封率