聚乙烯醇纺丝纤维编织在组织工程前交叉韧带支架材料中的应用

作者：戴丽冰，邹海燕，叶春婷，白利明，杨小红，沈雁，陈鸿辉，谭见容

【摘要】 探讨聚乙烯醇（PVA）纺丝纤维编织用I型胶原胶（COL-I）表面修饰后，构建组织工程前交叉韧带（ACL）支架材料的可行性。用PVA纺丝编织成条束状支架材料，用NIH-3T3细胞株和人前交叉韧带（HACL）细胞分别种植到PVA和经COL-I修饰过的PVA纺丝纤维编织（PVA/COL）支架材料上，立体培养。通过扫描电子显微镜对比评价材料经I型胶原胶表面修饰前后NIH-3T3细胞株和HACL细胞在纺丝编织材料上细胞附增殖情况；在电子拉力机上测试PVA纺丝纤维编织支架材料的力学性能。结果表明：NIH-3T3细胞株和HACL细胞在PVA和PVA/COL支架材料表面和孔隙内黏附增殖并分泌细胞外基质，在PVA/COL支架材料上细胞黏附数量明显增多； COL-I可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质，但对HACL细胞作用不明显。拉力测试该编织材料柔韧性强，最大负荷、极限应力和弹性模量分别为52.61 N、14.96 Mpa和202.08 Mpa。说明I型胶原可促进NIH-3T3细胞株和HACL细胞在聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料表面和孔隙内黏附、增殖，可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质。聚乙烯醇纺丝纤维编织材料具有一定的力学性能和细胞相容性，有望成为一种组织工程前交叉韧带支架材料。

【关键词】 聚乙烯醇；纺丝编织；I型胶原；前交叉韧带；组织工程

Abstract：To investigate the application feasibility of PVA scaffold modified by COL-I to construct anterior cruciate ligament tissue engineering.Braide stripe scaffold with PVA spinning collagen waving.NIH-3T3 cell line and human anterior cruciate ligament cells(HACL) were cultured and expanded in vitro and they were seeded into the scaffold which was braided with PVA， and PVA was modified by COL-I(PVA/COL). The growth situation of seeded cells into the scaffold was observed under the scanning electron microscope(SEM)，the mechanical properties of the scaffold was tested with the electronic tensioner.Results showed that the porous structure of the scaffold facilitated the attachment and proliferation of NIH-3T3 cell line an HACL cells， and extracellular matrix was secreted. Cells adhered and spreaded better on the PVA/COL scaffold than on the PVA materials. COL-I could promote NIH-3T3 cell line to secrete extracellular matrix ，but no obvious effect on HACL was found. Pull tests showed that the flexibility of the material was strong，the peak load was 52.61N，the ultimate stress and elastic modulus was 14.96 Mpa and 202.08 Mpa respectively.COL-I could promote the attachment and proliferation of NIH-3T3 cell line and HACL cells，it also can promote NIH-3T3 cell line to secrete extracellular matrix， the scaffold braided with PVA/COL provide with good mechanical properties and biocompatibility，it is hopeful to become a useful scaffold in anterior cruciate ligament tissue engineering.

Key words：Polyvinyl alcohol; Spinning braiding; Type I collagen; Anterior cruciate ligament; Tissue engineering

1 引 言

前交叉韧带（anterior cruciate ligament，ACL）的断裂一般难以自愈，目前主要的治疗方法是自体或异体移植物和人工合成材料进行ACL重建。自身供体存在来源有限、供区并发症等问题。异体移植存在免疫排斥和疾病传播的风险且也受存在来源限制。无活性的各种人工合成替代材料重建ACL远期疗效还存在争议，限制了其临床应用。组织工程技术的发展和应用为ACL重建提供了新的思路和途径。

I型胶原蛋白是一种具备生物活性的大分子物质，是细胞外间质的主要成分。它与细胞的增生、分化以及眼球的润滑、折光率等有着密切的关系，对伤口愈合、血液凝固起着重要的作用。胶原分子结构的不对称性和大量亲水基团的存在，使之具有高度的黏附性和亲水性。在细胞迁移时能起支持和润滑作用，还可诱导产生趋化因子如血小板生长因子和纤连蛋白等，从而对细胞的生长有趋化作用［1］。此外，胶原蛋白体内应用不仅具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性，还具有药物缓释的功能。因此，胶原蛋白作为一种安全的医用生物材料已广泛用于科研和临床，美国食品药物管理局（FDA）已批准其作为人工皮肤的材料［2-3］。

本实验拟用聚乙烯醇（polyviny alcohol，PVA）纺丝纤维编织构建韧带支架材料，并用I型胶原胶进行表面修饰，观察胶原胶是否能促进NIH-3T3细胞株、人ACL细胞(Human ACL，HACL细胞）在编织材料上黏附增殖，并对其力学性能进行测试。

2 材料和方法

2.1 材料

I型胶原蛋白胶为广州市创伤外科研究所研制的胶原胶制剂。（取大鼠尾筋腱用酸溶解法提取I型胶原［4］，胶原提取液透析纯化为胶原胶，经双缩脲试验、凯氏定氮试验、氨基酸成分分析、SDS-PAGE电泳、羟脯氨酸含量、紫外光谱最大吸收峰max≌226 nm、奥氏黏度计比黏度试验η=50±10、pH=5.5±0.1、蛋白浓度（3±0.2）g/L，证明确属I型胶原蛋白。胶原蛋白的商业性提取方法已获得美国专利登记NO.2979438.1961）。

2.2 主要试剂和仪器

高糖DMEM培养基（Dulbecco′s modified Eagles medium）Gibco（USA）；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；25 cm2细胞培养瓶(Corning，USA)；6孔细胞培养板(Corning，USA)；NIH-3T3细胞株，PVA纺丝纤维(上海东华大学材料科学与工程学院)；0.2-200 μL微量加样器(Nipar，Japan)；光学显微镜（ECLIPSE E400，Nikon Japan）；倒置显微镜（IMP-2 OLMPUS，Japan）；自动平衡离心机（LDZ4-0.8，北京离心机厂)；高速冷冻离心机(SORVALL RC 5C，USA）；CO2培养箱(SHELLAB2323，USA)；超净工作台(苏州苏净集团安泰公司)；电子拉力测试机(Hounsfield H25KSS，UK）；扫描电子显微镜(PHILIPS ESEM-30)；60Co放射源(广州辐照技术研究中心)。

2.3 实验方法

2.3.1 支架材料的制作和分组 用PVA纺丝经过手工编织形成有孔、无色透明、质地较柔软、具有一定韧性和弹性的条束状支架材料。修剪成21 mm×2.4 mm×1.4 mm大小的韧带支架材料若干条。分别经0.1 mol/L稀盐酸(HCL)—蒸馏水—0.1 mol/L氢氧化钠(NaoH)—蒸馏水超声洗涤，以彻底清除在纺丝和编织过程中黏附在纤维表面和孔隙内的杂质和污物。60Co（7kGy）辐照消毒灭菌后分2组：PVA组和PVA/COL组。PVA组材料种植细胞前用DMEM培养基充分浸泡。PVA/COL组材料种植细胞前用DMEM培养基浸泡，再用I型胶原蛋白胶行表面修饰。

2.3.2 支架材料的表面修饰 用（3.0±0.2）g/L鼠尾I型胶原蛋白胶（COL-I）浸泡—干燥—再浸泡行表面修饰。为了使编织材料内部也能均匀地包被胶原蛋白，采用低温负压抽真空，将编织材料内部的气体排干净。浸泡完成后在超净工作台上自然干燥，种植细胞前用DMEM培养基浸泡。

2.3.3 材料的细胞相容性检测 用NIH-3T3细胞株体外培养、扩增后，以1×108 L-1的细胞悬液种植于PVA组和PVA/COL组支架材料上。37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱内孵育4～6 h，待细胞贴附于支架材料后，加入含体积分数0.1的胎牛血清的DMEM继续立体培养。隔天换培养液1次，3 d和7 d收集细胞－支架材料复合物。

取前交叉韧带断裂重建手术患者的ACL组织，经患者或家属知情同意。按照组织块和胶原酶消化培养法在体外分离培养并扩增HACL细胞［5］。取3～5代HACL细胞悬液，以1×108 L-1的浓度种植于PVA组和PVA/COL组支架材料上，2 h后复种1次，37 ℃、5% CO2培养箱内孵育4～6 h，待细胞贴附于支架材料后，加入含体积分数0.1的胎牛血清的DMEM继续培养，隔天换培养液1次，3 d和7 d收集细胞－支架材料复合物。

细胞－支架材料复合物经2.5 %戊二醛固定、常规脱水、CO2临界点干燥、喷金、扫描电子显微镜（500～2000倍）对比观察纺丝纤维编织支架材料经I型胶原胶表面修饰前后NIH-3T3细胞株和HACL细胞在纺丝编织材料上细胞的粘附增殖情况。

2.3.4 材料的力学性能检测 取6条编织好的支架材料充份浸泡湿润后，在电子拉力机上以速度100 mm/min、初始长度为1 cm进行负荷—拉伸测试，记录最大负荷、极限应力、最大应变及线性刚度力学指标，应用SPSS11.5软件包进行分析。

3 结果

3.1 NIH-3T3细胞株和HACL细胞在支架材料上

的生长及细胞外基质的分泌情况电镜扫描可见支架材料表面光滑，孔径大小不一，相互惯通，纤维纵横交错，呈三维连通的编织网状结构；NIH-3T3细胞株和HACL细胞在PVA和PVA/COL支架材料表面和孔隙内黏附增殖并能分泌细胞外基质，NIH-3T3细胞株比HACL细胞生长旺盛。

3.1.1 NIH-3T3细胞株在支架材料生长情况 NIH-3T3细胞株在PVA和PVA/COL支架材料表面、孔隙内及周边呈卵圆形层叠、成堆、三维黏附生长。随着培养时间的延长，黏附在支架材料上的细胞逐渐增多，并分泌细胞外基质。在PVA/COL支架材料上细胞黏附数量明显增多、非常密集且分泌细胞外基质都较在PVA支架材料上丰富，但在PVA支架材料上细胞生长形态较好，见图1。

3.1.2 HACL细胞在支架材料的生长情况 HACL细胞在PVA和PVA/COL支架材料表面、孔隙内呈梭形或多角形伸出伪促与支架材料粘附，随着培养时间的延长，黏附在支架材料上的细胞逐渐增多并伸出伪足与支架材料黏附，有些细胞之间彼此相连成片状或网状黏附于支架材料。在编织支架材料表面及孔隙内有较多纤维丝状物质，纤维丝排列紊乱，没有规律性。HACL细胞在PVA/COL支架材料上细胞黏附数量明显增多，在PVA支架材料上细胞生长形态较好， HACL细胞在PVA/COL支架材料上细胞外基质分泌不明显，见图2。

3.2 支架材料拉力测试的负荷—拉伸曲线和应力—应变曲线具有与韧带组织相似的非线性变化的特征，极限抗张强度达到了人前交叉韧带的力学要求（见表1）。表1 聚乙烯醇编织支架材料的拉力测试结果

4 讨论

PVA是一种水溶性高分子化合物，材料的亲水性能好，具有良好的水溶性和组织相容性，力学性能强，柔韧性好，无毒性，目前广泛应用于医学领域。其分子链中的侧链羟基可以结合黏附蛋白而对细胞具有较强的黏附作用，有利于细胞在PVA材料上黏附生长和增殖［6-7］。人体内虽缺乏PVA降解酶，但改进制备后的PVA材料具有生物降解性［8-9］，因此可作为组织工程的应用材料。尽管PVA支架材料有很多用途，但单纯的PVA对细胞的吸附能力是有限的［10］。而胶原作为韧带组织最主要的细胞外基质，可以促进组织的修复，对细胞的黏附、迁徙、增殖起重要作用［11-12］。有研究表明，PVA材料经过纤维连接蛋白或多肽表面修饰后可以促进细胞的粘附［6，10，13］。

实验使用I型胶原蛋白胶对PVA编织材料进行表面修饰，发现材料表面有一层胶原膜， 可以促进NIH-3T3细胞株及HACL细胞在材料表面及其孔隙内黏附和增殖，并能分泌细胞外基质。这可能与I型胶原为NIH-3T3细胞株及HACL细胞提供了更多的结合位点有关［14-15］。

用编织技术构建组织工程ACL支架材料是目前发展趋势之一。编织材料可以较好地模拟ACL纤维走向，可改善力学性能。两端骨隧道部分和关节内部分的编织纤维可以形成不同的孔径结构，有利于新生组织长入，为韧带血管化和再生创造了条件［16-19］。

本实验用PVA纺丝纤维编织韧带支架材料，其负荷—拉伸曲线与人ACL的相似，且细胞相容性好。但与人ACL相比，还不能满足体内移植的力学要求。这可能与PVA纺丝纤维的纤度、直径、编织材料孔径结构、孔隙率、编织的角度、纤维的松紧度等因素有关。Helen等［20］研究提示，使用纤度较低和直径较细的纤维，有助于提高支架材料力学性能。这可能由于降低纤维纤度和直径后，单位体积内通过的纤维数量增加，从而提高其力学性能。另外，纤维数量增加后可以提高支架材料的表面积，有利于种子细胞在支架材料上黏附和营养物质的交换。

选择合适的种子细胞是组织工程关键之一［21］。我们前期实验发现，HACL细胞作为韧带的结构和功能单位，在体外培养时可以较好地保持韧带细胞表型，分泌I、III型胶原蛋白能力强，具备了作为组织工程前交叉韧带种子细胞的一些条件［22］。但HACL细胞在体外培养时细胞增殖相对缓慢且容易老化，如能解决这些问题，HACL细胞不失为理想的种子细胞。

COL-I可促进NIH-3T3细胞株和HACL细胞在PVA编织材料上黏附、增殖［18］。COL-I促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质，但对HACL细胞作用不明显，原因有待进一步研究。NIH-3T3细胞株和HACL细胞在PVA/COL支架材料上细胞生长形态不如PVA支架材料上好，这可能与I型胶原胶的pH值影响有关。细胞生长适宜的pH值是7.2～7.4，而胶原蛋白是一种酸溶性蛋白，其溶液随浓度增大、pH升高有明显的聚集行为［23］。当胶原胶pH值超过6.0，胶原胶就会凝集如凝膏状，使之难以与材料进行表面修饰。

I型胶原可促进NIH-3T3细胞株和HACL细胞在聚乙烯醇纺丝纤维编织支架材料表面和孔隙内黏附、增殖，可促进NIH-3T3细胞株分泌细胞外基质。但I型胶原胶对材料的修饰方法尚需进一步完善，如偿试降低Ⅰ型胶原胶的浓度来提高pH值，减低因pH值因素对细胞不良的刺激。聚乙烯醇纺丝纤维编织材料形成具有孔径结构的三维支架，具有一定的力学性能和细胞相容性，有望成为一种组织工程前交叉韧带支架材料。