聚乙烯亚胺单独及与三种抗菌药物联用对白念珠菌的体外抗菌活性

作者：陈涛 卢婷利 张琰 傅经国

【摘要】 目的 评估多支链的阳离子高分子聚合物——聚乙烯亚胺(PEI)单独及与三种不同类别的常规抗菌药物(两性霉素B、氟康唑和多黏菌素B)联合使用对白念珠菌(MY7245和MY7238)的两种临床分离物的抗真菌活性。方法 通过体外实验测定不同分子质量聚乙烯亚胺单独及与三种不同类别的常规抗菌药物联合使用对两株白念珠菌的最小抑菌浓度和杀灭时间，确定PEI单独及联合使用的体外抗真菌活性。结果 分子量在2～745ku范围内的PEI均对这两种白念珠菌产生很好的抗真菌活性，且分子量小的PEI比分子量大的PEI的抗菌作用更显著。与单独作用的PEI相比，分子量较大的PEI与常规药物联合使用时可产生较强的协同作用。在体外致死研究实验中可以看到，PEI-两性霉素B和PEI-氟康唑结合物可以提高抑菌作用，但PEI-多黏菌素B结合物却拮抗抑菌作用。结论 PEI单独与联合使用均对白念珠菌产生很好的抗菌效果。

【关键词】 聚乙烯亚胺； 抗菌药物； 白念珠菌； 体外抗真菌活性

ABSTRACT Objective To evaluate the antifungal activity of branched synthetic polymer， polyethylenimine(PEI)， alone and in combination with different antimicrobial agents against two clinical isolates of Candida albicans (MY7458 and MY7238).MethodsThe minimal inhibitory concentration (MIC) and time-killing rate of different sizes of polyethylanimine， alone and in combination with the drugs against two isolates of Candida albican were investigated.ResultsIt showed that PEIs at the molecule weight range of 2 to 745 ku were all efficiently fungicidal against two C.albicans isolates. Moreover， the smaller sized of PEIs were relatively more potent than its larger molecule counterpart. In contrast to fungicidal activity of PEI alone， larger sized PEI resulted in a higher synergistic effect when combining with the conventional antimicrobial agents. In vitro time-killing studies， the combination of PEI-amphotericin B and PEI-fluconazole enhanced antifungal activity， but there was an antagonist for the combination of PEI-polymyxin B.ConclusionsPEI alone and in combination with amphotericin B and fluconazole displayed the high antifungal activity against Candida albicans.

KEY WORDS Polyethylanimine;Antimicrobial agents;Candida albicans;In vitro anti-fungal activity

近年来，全身性真菌感染类型与频率急剧上升［1，2］，白念珠菌是最普通的真菌病原体，是形成人体中大多数局部真菌感染的主要原因［3～5］。两性霉素B与唑类化合物(如氟康唑、酮康唑)是目前应用最广泛的抗菌药物［6］，两性霉素B有着广谱和有效的杀真菌活性，但与唑类化合物相比却有着较大的毒性和较小的身体耐受性［7］。唑类抗真菌剂虽然具有较小的毒性［8］，但长期广泛地使用已经增加了念珠菌属对氟康唑的耐受性并且出现了一些交叉耐药性的迹象，因此迫切需要增加抗真菌药物的治疗指数，其中联合使用一些抗真菌剂使其协同地发挥作用［9～11］，是被临床证实的有效方法。

研究发现，带正电荷的阳离子多肽对细菌和真菌有很强的杀灭作用，聚乙烯亚胺(PEI)是一种阳离子高分子聚合物，可作为一种体内和体外基因传染和递送的载体［12］。我们研究了PEI单独使用对白念珠菌的体外抗真菌活性［13］，而抗菌药物与PEI的联合使用未见报道。本文报道PEI与两性霉素B、氟康唑和多黏菌素B联合使用来抑制白念珠菌临床分离物的体外敏感性测定。

1 材料和方法

1.1 材料

微生物菌株MY7245和MY7238分别来自全身真菌感染的患者黏膜并经过微生物菌属鉴定为白念珠菌，菌株保存于4℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基。三种不同分子量(745、25、2ku)的PEI、两性霉素B和多黏菌素B硫酸盐均购自Sigma公司，氟康唑购自Pfizer公司。三种不同分子量的PEI均为无色或淡黄色液体，树脂含量＞98%，5% PEI水溶液pH10～12，使用前将其pH调至7.0～7.2。所有样品用重蒸馏水溶解配制为浓度10mg/L的溶液。

1.2方法

(1)抗真菌测定 体外抗真菌测定依据美国临床实验室标准化研究所(CLSI/NCCLS，2004年)制定的大量稀释标准进行。测试培养基采用RPMI 1640(Gibco/BRL)，用0.165mol/L的三吗啉丙磺酸(MOSP)缓冲液(pH7.0)配制。PEI与两性霉素B配制为RPMI 1640培养基的100mg/L溶液，并逐步稀释使最终浓度范围为100～0.98mg/L。氟康唑和多黏菌素B配制为RPMI 1640培养基的80mg/L溶液，并稀释使浓度范围为80～0.156mg/L。用血细胞计数操作准备浓度为1×106细胞/ml的接种物悬液，并稀释以获得1×104细胞/ml的接种量。抗真菌药物的最小抑菌浓度(MIC)定义为经37℃过夜培养(18～24h)后观察不到细菌生长的最小药物浓度；最小杀真菌浓度(MFC)定义为最终形成菌落数少于2～5个菌落形成单位时药物的最小浓度，表现为初始接种物的杀灭率大于98%。

(2)杀灭时间测定 生长于沙氏葡萄糖琼脂上的浓度为1×106细胞/ml的白念珠菌MY7458分离物按上述方法接种于RPMI 1640培养基中，并稀释获得约1×104细胞/ml的接种量。将1ml接种物悬液分装试管中，于30℃分别培养0、3、6、24h，并逐渐稀释到所需的浓度，接种在沙氏葡萄糖琼脂培养基上于37℃培养24h进行活菌计数测定。

2 结果

2.1 PEI的抗真菌活性

Tab.1是三种不同分子量的PEI和常规三种不同抗菌药物两性霉素B、氟康唑和多黏菌素B对白念珠菌MY7458和MY7238两种分离物的MIC与MFC值，说明PEI可抑制两种白念珠菌分离物的增长，同时三种不同分子量的PEI，其抗真菌活性有一定的差异。就MIC值而言，745ku与25ku PEI对MY7458的MIC值为3.12mg/L，对MY7238则是1.56mg/L，而2kuPEI对两种分离物的MIC值均为1.56mg/L。两性霉素B对MY7458、MY7238的MIC分别是0.39和0.79mg/L，表明它的抗菌活性高于所有测试的PEI。氟康唑对这两种分离物的MIC值均为1.56mg/L，而抑制同样数量的真菌则需要更高剂量的多黏菌素B(100mg/L)。为证实PEI及其它抗真菌剂的杀菌活性，亦评估了MFC。为杀灭MY7458需要浓度超过50mg/L的抗真菌药物，而杀灭MY7238仅需要浓度为6.25mg/L的25ku PEI与745ku PEI，但需要浓度超过50mg/L的其他抗真菌药物。

Tab.2是0.5倍MIC的次抑菌浓度的PEI与三种抗菌剂联合使用时的MIC值，与抗菌剂单独使用时相比，联合使用的MIC均有所下降。两性霉素B的MIC值由不加PEI的0.39mg/L降至0.097mg/L，而氟康唑的MIC值则由1.56mg/L降低至0.79mg/L，但对PMB而言加入PEI不对抗菌活性产生任何效果。同时表中的数据还表明，PEI的分子量大小不影响抗真菌剂的MIC值。

2.2 杀灭时间测定

Fig.1是浓度为0.5、1、2倍MIC的25ku PEI杀死MY7458的动力学，纵坐标为真菌生长的对数值。图中曲线表明，与不含PEI的对照样品相比，所有浓度下培养3h之后，真菌生长减少了大约0.5对数生长量，6h之后则减少约2～2.5对数生长量，且杀灭率随PEI浓度的增加而提高，这一增加的效果在24h后则更为显著。这些结果表明PEI的杀菌缓慢(暴露时间)并具有浓度依赖性。

2.3 PEI联合其他抗菌药物的效果

Fig.2是两种分子量的PEI(A：25ku，B：2ku)与两性霉素B、氟康唑及多黏菌素B联合抗MY7458的结果，每种药物的浓度为0.5倍MIC的次抑菌浓度。表明当在这三种常规抗菌药物中添加两种不同分子量

1: PSB; 2: 0.5×MIC; 3: 1×MIC; 4: 2×MIC

Fig.1The antifungal activity of PEI (25 ku) against

C.albicans isolate MY7458 (n=4， x±s)

的PEI时，都会使白念珠菌生存力有所下降，表明PEI的加入都或多或少地提高了常规抗菌药物的活性，从其作用程度比较，两性霉素B的促进作用最显著，氟康唑次之，多黏菌素B的幅度最小。从PEI的浓度比较，浓度较大的PEI更有利于常规药物抗真菌活性的提高。灭时间测定结果，表明联合抗菌药物的效果较缓慢且好于单一药物，经过6h的治疗可以清楚地观测到真菌生长的抑制，24h后对真菌的抑制更加显著，表明聚合药物的抗菌效果依赖于长时间的暴露。

3 讨论

聚乙烯亚胺(PEI)是一种广泛用于各种生物工艺过程的合成阳离子聚合物，常作为体外和体内的基因载体，研究发现它对白念珠菌具有抗真菌活性［13］。为探究PEI在治疗真菌感染中可能的应用，我们在常用抗菌药物的抗真菌活性基础上，研究了不同浓度PEI的抗菌效果。与氟康唑相比，在低浓度时PEI抑制白念珠菌分离物的生长，其活性强于多黏菌素B，但弱于两性霉素B。同时MFC测定获得的结果也表明，利用更高浓度抗真菌剂稀释的标准液体培养基，极少能观察到完全抑制真菌的生长，但分子量为25和745ku的PEI对MY7238分离物的抑制则是例外。PEI与其他抗真菌剂的MIC和MFC的区别，表明这些抗真菌剂和PEI在膜上的作用靶点并不类似，因此需要进一步的研究以确定PEI与膜之间的相互作用机制。研究结果表明PEI浓度较高时对两性霉素B的活性有重要的促进作用，而在氟康唑和多黏菌素B的基础上的作用较微弱，每种化合物的细胞作用靶点不同是PEI效果差异的一个原因。事实上，氟康唑作用于细胞质中参与麦角固醇生物合成的羊毛固醇去甲基化酶，因此在氟康唑的存在下PEI应当在一定程度上干扰细胞膜，增加了氟康唑进入细胞质的流入量，结果导致对白念珠菌的轻微抑制，其效果比单独使用氟康唑好。两性霉素B的主要作用靶点是麦角固醇，它是真菌细胞膜的一个组成成分。两性霉素B与作用靶点结合导致细胞膜通透性的改变，使钾、糖和代谢产物释放出来，导致真菌死亡。尽管PEI(特别是浓度较高的PEI)与两性霉素B之间的相互作用的机制还不清楚，但它们两者对白念珠菌的协同作用却是肯定的。这可能是由于PEI促进两性霉素B的细胞摄取而导致真菌细胞膜完整选择性的丧失，和(或)这种抗真菌剂作用靶点和两性霉素B在细胞膜内部的孔结构的相互作用，增加了它的活性。由于麦角固醇位于质膜上，PEI对细胞膜的改变能使麦角固醇容易地暴露给两性霉素B，也就是说，由于PEI本身的阳离子特性，使它可以嵌入质膜或与阴离子型膜组分(如蛋白和磷脂)相互作用而破坏细胞膜。

多黏菌素B是一种碱性多肽类抗菌药物，其作用靶点位于细菌的外膜，这种多肽与其靶点的结合增加了外膜的透化作用，使化合物进入到细胞质膜中，造成细胞质组分外漏，导致细胞死亡。用多黏菌素B与三种不同分子量的PEI对真菌分离物联合治疗结果表明，对其抗真菌效果没有明显地促进作用，提示PEI与多黏菌素B之间不会发生有利于增加彼此进入的相互作用。

PEI具有一定的抗真菌活性，且这种抗真菌性与PEI浓度高低关系不大，同时与常规药物联合使用表明，在一定浓度下与两性霉素B具有正效应的抗真菌活性，而不对氟康唑与多黏菌素B具有积极的促进效果，这种差异可能与PEI的作用靶点、膜通透性以及PEI与常规药物联合使用的机制有关。PEI与两性霉素B联合使用还有待做进一步探索。

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