聚乙烯醇编织构建组织工程前交叉韧带的初步研究

作者：白利明，陈鸿辉，邹海燕，叶春婷，沈雁，戴丽冰，梁佩红

【摘要】 目的］探讨聚乙烯醇体外编织构建组织工程前交叉韧带支架材料的可行性。［方法］用聚乙烯醇纺丝纤维编织构建韧带支架材料，在电子拉力机上测试该支架材料的力学性质；用组织块和胶原酶消化培养法在体外分离培养人前交叉韧带细胞并对细胞的生长形态和分泌胶原蛋白的特征进行检测，细胞经体外扩增后种植于编织构建的聚乙烯醇韧带支架材料上观察。［结果］韧带支架材料的柔韧性强，拉力测试的负荷—拉伸曲线与韧带的拉伸曲线相似，其最大负荷、极限应力和弹性模量分别为52.61 N、14.96 MPa和202.08 MPa；体外分离培养的人前交叉韧带细胞呈典型的成纤维细胞特征，能在体外分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质；支架材料无细胞毒性，人前交叉韧带细胞可在支架材料上黏附、生长并分泌细胞外基质。［结论］支架材料具有一定的力学性能和优良的生物相容性，有望成为一种组织工程前交叉韧带支架材料。

【关键词】 聚乙烯醇； 支架； 编织材料； 前交叉韧带； 组织工程

前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)断裂是最常见的膝关节损伤之一。ACL断裂无法自愈，用自体或异体移植物重建ACL是目前常用的治疗方法［1］。自体移植物来源有限且多有供区部位并发症；异体移植物也受来源限制，且有传播疾病和产生免疫排异的风险；人工韧带材料重建ACL的远期疗效还有争议。组织工程技术的发展和应用为ACL重建提供了新的思路和方法。本文拟用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)编织构建韧带支架材料，经检测其性能，为临床上重建ACL提供新材料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 Ⅰ型胶原酶(Gibco，USA)，高糖型DMEM培养基(Gibco，USA)，Ⅰ、Ⅲ型胶原单克隆兔抗鼠抗体、羊抗鼠IgG、SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物公司)，PVA纺丝纤维(委托上海东华大学材料科学与工程学院制作)，60Co辐照消毒(广州辐照技术研究中心协助)，电子拉力测试机(Hounsfield H25KSS，UK)，激光共聚焦显微镜(ZEISS LSM510 META，Siemens，Germany)，扫描电子显微镜(PHILIPS ESEM30)。

1.2 方法

1.2.1 支架材料的制备和力学性能检测

1.2.1.1 将1条PVA纺丝纤维经过钩花制作为1条丝束，4条丝束为1股，用3股丝束编织构建组织工程ACL支架材料，60Co辐照消毒灭菌(8kGy)，种植细胞前使用DMEM培养基反复浸泡后过夜。

1.2.1.2 取6条编织好的支架材料充分浸泡湿润后，在电子拉力机上，以速度100 mm／min、初始长度为1 cm进行拉力测试，记录最大负荷、极限应力、最大应变及线性刚度等力学指标并绘制负荷—拉伸曲线，使用SPSS 11.5软件包进行分析。

1.2.2 ACL细胞的分离培养及鉴定

1.2.2.1 取骨性关节炎患者未受损的ACL组织，参照组织块和胶原酶消化培养法［2］在体外分离培养并扩增ACL细胞。

1.2.2.2 将培养3～5代ACL细胞进行吖啶橙(acridine orange，OA)染色，在激光共聚焦显微镜下观察ACL细胞的形态特征。

1.2.2.3 在ACL细胞中加Ⅰ型和Ⅲ型胶原单克隆抗体(浓度为1∶200)，阴性对照仅加PBS。按照SABC免疫组化试剂盒的步骤检测ACL细胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原的能力。

1.2.3 支架材料上种植ACL细胞

1.2.3.1 取3～5代ACL细胞悬液，以1×105／ml的浓度种植于支架材料上，2 h后复种1次，然后在37℃、5％CO2培养箱内孵育4～6 h，待细胞贴附于支架材料后，加入含10％胎牛血清的DMEM继续培养，隔天换培养液1次，7 d后收集细胞—支架材料复合物。

1.2.3.2 细胞—支架材料复合物经2.5％戊二醛固定、常规脱水、CO2临界点干燥、喷金，扫描电镜观察细胞在支架材料上的生长情况。

2 结果

2.1 编织构建的ACL支架材料无色透明，质地韧，充分浸泡后体积略有膨胀，柔韧性更强。拉力测试的负荷—拉伸曲线与韧带的拉伸曲线相似，最大负荷为52.61±6.22 N，极限应力为14.96±2.28 MPa，弹性模量为202.08 MPa(表1)。

表1 聚乙烯醇编织支架材料拉力测试结果（略）

2．2 在体外分离培养的人ACL细胞形态呈梭形或多角形，核呈圆形或卵圆形，位于细胞中央，胞质向外伸出数个长短不一的突起，呈典型的成纤维细胞特征(图1、2)。Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化测定可见ACL细胞的胞浆内富含橙黄色颗粒，主要分布在细胞核周围，胞浆外无橙黄色颗粒出现，表明ACL细胞的胞浆内富含细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原，通过图像分析可知细胞所分泌的I型胶原明显较Ⅲ型胶原多(图3、4)。

2.3 电镜扫描可见支架材料孔径大小不一，相互贯通，呈三维编织网络结构；支架材料表面和孔内均有细胞生长，ACL细胞在支架材料上贴附生长并分泌细胞外基质(图5、6)。

3 讨论 组织工程ACL的关键要素之一就是要选择合适的种子细胞。ACL细胞作为韧带的结构和功能单位，在体外培养时可以较好地保持韧带细胞表型，分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原能力强，有利于韧带组织重建。Cooper JA等［3］将兔ACL、内侧副韧带、髌韧带、跟腱4种成纤维细胞体外分离培养后，分别种植于编织的聚乳酸(polylactic acid，PLA)ACL支架材料上，结果发现ACL细胞分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白(fibronectin，FN)表达水平均高于其他3种成纤维细胞，认为ACL细胞作为组织工程ACL的种子细胞，可能优于其他3种成纤维细胞。本实验在体外分离培养的ACL细胞形态呈梭形或多角形，细胞核呈圆形或卵圆形，位于细胞中央，胞质向外伸出数个长短不一的突起，呈典型的成纤维细胞特征。Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化测定表明，在体外培养的ACL细胞具有分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原的能力，且细胞分泌I型胶原比Ⅲ型胶原多。有研究表明［4］，人前交叉韧带中Ⅰ、Ⅲ型胶原的比例约为8∶1，ACL细胞分泌的Ⅰ型胶原明显多于Ⅲ型胶原。但ACL细胞在体外培养时细胞增殖相对缓慢，如能解决其快速增殖和老化的问题，不失为理想的种子细胞。 PVA是一种水溶性高分子化合物，由醋酸乙烯酯溶液聚合后，再经碱催化醇解而得。PVA具有良好的水溶性和组织相容性，力学性能强，柔韧性好，无毒性，目前已广泛应用于医学领域。其分子链中的侧链羟基可以结合黏附蛋白而对细胞具有较强的黏附作用，有利于细胞在PVA材料上黏附生长和增殖［5］。人体内虽缺乏PVA降解酶，但PVA材料改进制备后具有生物降解性［6，7］。潘政军等［8］曾用PVA与胶原共聚物在体外构建了组织工程ACL支架材料，发现其具有优良的生物相容性和一定的力学性能。

图1 组织块培养的原代ACL细胞倒置相差显微镜(100×) （略） 图2 第3代ACL细胞AO染色激光共聚焦显微镜(100×)（略）

图3 第3代ACL细胞分泌Ⅰ型胶原普通光学显微镜(200×) （略）

图4 第3代ACL细胞分泌Ⅲ型胶原普通光学显微镜(200×)（略）

图5 ACL细胞在支架材料上分泌细胞外基质(SEM1000×) （略）

图6 ACL细胞在支架材料上黏附生长(SEM125×)（略） 用编织技术构建组织工程ACL支架材料是目前发展趋势之一。编织支架材料可以较好地模拟ACL纤维走向，可改善力学性能，两端骨隧道部分和关节内部分的编织纤维可以形成不同的孔径结构，有利于新生组织长入，为韧带血管化和再生创造了条件［9］。JamesAC等［10］使用PLA纤维在体外编织构建的人ACL支架材料其最大负荷可以满足人正常生理活动的需要，ACL细胞可以在支架材料上黏附、增殖和分泌细胞外基质。与前期实验中PVA-胶原共聚物膜韧带支架材料相比，本实验编织韧带支架材料的极限应力有所提高［8］，负荷—拉伸曲线与人ACL的相似，具有黏弹性的性质，材料的韧性增加，且有优良的细胞相容性；与人ACL相比，还不能满足体内移植的力学要求，这可能与PVA纺丝纤维直径较粗、纤度大，单位体积内的纺丝纤维数量较少，人工编织的角度、纤维走向、松紧程度等因素有关；与目前研究较多的聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等高分子材料相比，具有一定的优势，PVA材料的亲水性和柔韧性强，力学性能好，降解时间长，不会在局部产生酸性产物而引起炎症反应。 在体外编织构建的ACL支架材料，具有一定的韧性和力学性能，ACL细胞可以在支架材料上黏附、增殖，具有良好的细胞相容性，但仍需通过改变PVA的分子量及制备工艺，使用机械编织，改进编织技术，进一步改善韧带支架的力学性能，使之更接近ACL的力学要求，以期成为一种较理想的组织工程ACL支架材料。

【参考文献】 ［1］ Savio LY W， Changfu W， Ozgur D， et al.前交叉韧带重建与生物力学［J］.Journal of Orthopaedics and Research， 2006，1(9):31-39. ［2］ 陈鸿辉，唐毅，李斯明，等.膝关节韧带成纤维细胞的培养及其生物学特性分析［J］.中华骨科杂志，2002，22(1):40-44. ［3］ Cooper JA， Bailey LO， Carter JN， et al.Evaluation of the anterior cruciate ligament，medial collateral ligament， Achilles tendon and patellar tendon as cell sources for tissueengineered ligament［J］. Biomaterial， 2006，27(13):2747-2754. ［4］ Zigang G， Fang Y， James CHG， et al.Biomaterials and scaffolds for ligament tissue engineering［J］. Bio Med Mater Res，2006，77:639-652. ［5］ Rachael H， Schmedlen， Kristyn S，et al.Photocrosslinkable polyvinyl alcohol hydrogels that can be modified with cell adhesion peptides for use in tissue engineering［J］. Biomaterials，2003，23:4325-4332. ［6］ Charles R， Nuttelman，Scott M，et al. Synthesis and characterization of photocrosslinkable， degradable poly(vinyl alcohol)based tissue engineering scaffolds［J］. Biomaterials，2002，23:3617-3626. ［7］ Congming X， Gaoyan Z. Synthesis and properties of degradable poly(vinyl alcohol) hydrogel［J］. Polymer Degradation and Stability， 2003， 81: 297-301. ［8］ 潘政军，陈鸿辉，叶春婷，等.聚乙烯醇/胶原共聚物在组织工程前交叉韧带支架材料中的实验研究［J］.中国矫形外科杂志，2004，12(5)：368-370. ［9］ Ge Z， Goh JCH， Wang L， et al. Characterization of knitted polymeric scaffolds for potential use in ligament tissue engineering［J］.Biomater Sci Polymer Edn， 2005，16(9):1179-1192. ［10］James AC， Helen HL，Frank KK， et al.Fiberbased tissueengineered scaffold for ligament replacement: design considerations and in vitro evaluation［J］.Biomaterials，2005，26:1523-1532.