近β钛合金表面微弧氧化处理对成骨细胞早期行为的影响

作者：赵领洲，张玉梅，魏艳萍，李健学

【摘要】 目的：观察微弧氧化（MAO）方法对近β钛合金Ti5Zr3Sn5Mo15Nb（TLM）表面处理后对成骨细胞早期行为的影响. 方法：用脉冲直流电源在两个不同电压下对TLM表面进行微弧氧化处理，并用电镜观察试样表面形貌. MTT方法检测成骨细胞增殖，用商业试剂盒检测总蛋白合成及碱性磷酸酶（ALP）活性. 结果：微弧氧化处理可以在TLM表面形成一层多孔生物活性氧化层，其形貌与微弧氧化电压有关，低电压时形成的孔洞结构较小，高电压时形成的孔洞结构较大. 成骨细胞在微弧氧化表面的早期增殖（24，72，120 h）及7 d细胞总蛋白合成明显高于抛光表面，且细胞在高电压微弧氧化表面的增殖优于低电压表面. 而培养7 d后微弧氧化表面的细胞ALP活性明显低于抛光表面，且高电压表面的最低. 结论：微弧氧化处理改变了TLM表面形貌以及其它特性，从而促进成骨细胞在其表面的增殖及合成分泌活性，但抑制其ALP活性. 不同电压下形成的不同微弧氧化形貌对成骨细胞的早期行为有影响.

【关键词】 钛合金；微弧氧化；表面特性；成骨细胞

0引言

目前，广泛应用于临床的纯钛和Ti6Al4V种植体材料中存在着铝（Al）和钒（V）的潜在毒性及弹性模量太大易造成界面应力屏障等问题. 为此，我们开发了一种不含Al和V的近β钛合金Ti5Zr3Sn5Mo15Nb（TLM），其弹性模量较纯钛和Ti6Al4V低，并且其弹性模量、强度及可塑性等机械性能匹配优于其它报道的β钛合金［1］，有希望成为新一代骨植入材料. 体外细胞与种植材料的相互作用在一定程度上可以反映材料的生物活性. 细胞对材料的反应受到材料表面性质影响，目前普遍认为粗糙的表面形貌有利于促进细胞的生物学反应［2］. 微弧氧化（MAO）方法可以在材料表面生成一层多孔粗糙且与基底紧密结合的氧化膜，有利于改善种植体表面生物相容性［3］，而微弧氧化膜的表面特性如孔隙大小、孔隙率及粗糙度等可通过微弧氧化参数如电压等来控制调节. 我们采用两个不同的电压对TLM进行微弧氧化处理，观察不同形貌对成骨细胞早期增殖、总蛋白合成及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响.

1材料和方法

1.1材料TLM圆片（直径14.5 mm，厚度1 mm；西北有色金属研究院）；微弧氧化电源MAO100（西安交通大学金属材料强度国家重点实验室）；DMEM培养基（Gibco公司）；新生牛血清（Gibco公司）；MTT（Solarbio公司）；蛋白测定试剂盒和ALP测定试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；24/96孔培养板（Costar公司）；扫描电子显微镜（日本，JSM6460）.

1.2方法

1.2.1试样制备及试样形貌观察TLM圆片表面用碳化硅砂纸400号至1200号顺序抛光. 微弧氧化处理之前试样依次采用丙酮超声清洗15 min，去离子水30 min，空气干燥. 微弧氧化电解液含有0.04 mol/L βGP（C3H7Na2O6P·5H2O)和0.2 mol/L CA(C4H6CaO4·H2O)，电源频率100 Hz，占空比20%，处理时间5 min. 根据MAO所采用电压不同，试样分为3组：P：抛光组，作为对照；MAO300组：微弧氧化最终电压为300 V；MAO450组：微弧氧化最终电压为450 V. 试样在用于实验之前依次用丙酮、无水乙醇、750 mL/L乙醇及去离子水各超声清洗20 min，131℃高压蒸汽消毒30 min. 采用扫描电子显微镜观察试样表面形态，工作电压20 kV.

1.2.2细胞培养成骨细胞由胰酶胶原酶连续消化新生1 d大鼠头盖骨获得. 机械方法轻柔地去除头盖骨表面及骨缝处的软组织. 为了降低成纤维细胞污染，骨片先用胰酶消化90 min并弃上清. 细胞培养液为DMEM，100 mL/L新生牛血清、10 mL/L青霉素、10 mL/L链霉素. 成骨细胞表型由ALP及矿化结节染色验证. 37℃， 50 mL/L CO2湿润条件下培养， 2～5代用于细胞实验.

1.2.3细胞增殖实验试样放在24孔培养板内，每组试样随机选3个样本. 细胞接种密度为2×104/孔，细胞培养液为1 mL. 细胞培养24，72，120，68 h后终止细胞培养，PBS漂洗2次，每孔加入5 g/L MTT 200 μL和800 μL无血清无酚红DMEM. 37℃孵育4 h后吸弃上清，加入1 mL DMSO溶解生成的结晶物，每孔取3份200 μL 溶解液转移到96孔培养板，测A490 nm值.

1.2.4细胞总蛋白合成测定试样放置和细胞接种同细胞增殖实验. 细胞培养7 d后吸弃培养液，PBS漂洗2次. 每孔加入蒸馏水1 mL，3个冻融循环裂解细胞. 每孔取3份100 μL细胞裂解液转移到96孔培养板，空白孔加100 μL生理盐水，3个标准孔各加入100 μL标准蛋白（70 g/L），然后各加入200 μL蛋白测定试剂，37℃孵育30 min. 空白孔调零，测A570 nm值，总蛋白浓度=A570 nm样品/A570 nm标准×标准蛋白浓度，结果用7 d 的MTT A490 nm值标准化.

1.2.5细胞ALP活性测定采用细胞总蛋白合成测定的同一细胞裂解液测量细胞ALP活性. 每孔取3份100 μL细胞裂解液转移到96孔培养板，空白孔加入100 μL蒸馏水，然后各加入150 μL ALP测定工作液（使用前先37℃预保温10 min），37 ℃反应30 min后加入50 μL 1 mol/L NaOH终止反应. 空白孔调零，测A570 nm值并用细胞总蛋白合成标准化.

统计学处理: 采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，用方差分析和SNK检验比较组间差别，取α=0.05.

2结果

2.1试样表面形貌试样的表面形貌如图1所示，抛光表面可见沿抛光方向平行排列的沟槽，并可见散在于表面的金属薄片. 微弧氧化后表面沟槽消失，形成多孔结构，由均匀分布的火山口样突起相互连接组成，突起中央有孔洞存在. 当电压为300 V时，孔洞直径约0.2～2.5 μm；当电压升高到450 V，突起及孔洞的尺寸均增大，孔洞直径约1.0～7.0 μm，而孔隙率较300 V时低.

2.2成骨细胞在试样表面的增殖大鼠成骨细胞在TLM表面的增殖结果如图2所示. 在24 h和72 h，成骨细胞在微弧氧化表面的增殖均显著高于抛光表面（P<0.05）. 到120 h时，高电压微弧氧化表面细胞增殖仍显著高于抛光表面（P<0.05），低电压表面细胞增殖低于抛光表面但无统计学差异. 当培养168 h后，微弧氧化表面的细胞增殖数目与抛光表面的无统计学差异. 在24，120，168 h时，高电压微弧氧化表面的细胞增殖均明显高于低电压微弧氧化表面（P<0.05）. 从24 h至120 h，成骨细胞增殖迅速，而到168 h时成骨细胞增殖速度开始减慢.

2.3成骨细胞的总蛋白合成成骨细胞在不同TLM表面培养7 d后的细胞总蛋白合成用7 d MTT A490 nm值做标准化. 结果表明两个微弧氧化TLM表面的细胞总蛋白含量均显著高于抛光表面（P<0.05），不同电压微弧氧化表面细胞总蛋白无明显差异.

2.4成骨细胞的ALP活性成骨细胞的ALP A570 nm值用细胞总蛋白合成做标准化. 成骨细胞在不同TLM表面培养7 d后的ALP活性均明显低于抛光表面（P<0.05），高电压微弧氧化表面的细胞ALP活性明显低于低电压微弧氧化表面（P<0.05）.

3讨论

微弧氧化是一种在种植体表面形成多孔粗糙氧化层的理想的方法，而且该氧化层的形貌特征和粗糙程度可以通过调节电压等微弧氧化参数来改变. 微弧氧化膜的多孔结构是由于随着微弧氧化过程的进行，基体表面的氧化层越来越厚，于是局部出现微弧放电，击穿表面的绝缘氧化层而形成［4］. 随着微弧氧化最终电压的升高，微弧放电越剧烈，从而使得表面孔洞直径以及粗糙度更大. 而且伴随着TLM表面形貌的改变和粗糙度的提高，其它的一些与形貌和粗糙度相关的表面特性也有变化，如TLM的表面润湿性和表面能也有所提高，且与微弧氧化电压呈正相关关系.

细胞在材料表面的增殖受材料表面性质的影响. Kunzler等［2］报道大鼠头盖骨成骨细胞随着表面粗糙度增加增殖率明显增加. 材料表面高湿润性及高表面能也会促进细胞的增殖［5］. 我们的实验中，成骨细胞在微弧氧化TLM表面的早期增殖优于抛光表面，而且细胞在高电压微弧氧化表面的增殖优于低电压微弧氧化表面. 该结果与以前报道的规律是一致的，因为微弧氧化处理提高了TLM表面粗糙度及与粗糙度相关的表面润湿性和表面能，且这些效果与微弧氧化电压正相关. 我们还观察到细胞的早期增殖速度较快，而到168 h时细胞增殖速度开始减慢. 原因可能是培养168 h后试样上的细胞开始接触融合，从而出现接触抑制现象.

成骨细胞的总蛋白合成具有重要意义，它提示细胞在材料表面的健康生长和正常的细胞反应. 本实验中的总蛋白合成用MTT A490 nm值做了标准化，代表细胞的合成和分泌活性. 细胞的合成和分泌活性对材料的表面特性比较敏感［6］. 但关于材料表面特性对细胞总蛋白合成影响的报道不一，有报道不同特性表面的总蛋白合成无差异［7］，也有报道光滑表面的总蛋白合成较低［8］. 我们的实验结果与后者相似，TLM表面微弧氧化处理后促进成骨细胞的合成和分泌活性，但不同电压微弧氧化表面之间效果无差异. 造成各实验报道差异的原因尚不清楚，所使用的细胞来源不同以及所使用的实验方法不同可能是其原因之一.

ALP活性是成骨细胞分化的一个重要标志，目前普遍接受的观点认为材料表面粗糙度的增加会促进细胞分化，而且也有报道微弧氧化纯钛促进人骨肉瘤细胞ALP活性 ［4］. 我们的结果与此相反，TLM微弧氧化后粗糙度增大，但成骨细胞的ALP活性却受到抑制. Zhu等［3］的实验结果却是微弧氧化表面的细胞ALP活性与对照组无统计差异. 由此可见，关于材料表面特性对细胞分化的影响还存在分歧，我们的实验中微弧氧化TLM表面成骨细胞ALP活性降低的具体原因还需进一步实验探索.

综上所述，微弧氧化处理可在TLM表面形成一层多孔粗糙的氧化层，且该氧化层的特性如孔洞直径和粗糙度随微弧氧化电压的升高而增大. 微弧氧化处理促进成骨细胞在TLM增殖及合成和分泌活性，但抑制成骨细胞的ALP活性，且高电压微弧氧化表面促进增殖和抑制ALP活性作用更明显. 其中微弧氧化促进成骨细胞合成分泌活性和抑制其ALP活性的具体机制有待研究.

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