可控微结构EBM钛合金支架与成骨细胞的体外三维复合培养

作者：李国臣 王林 桑宏勋 李祥 王成焘 黄鑫 雷伟 姥伟

【摘要】 [目的]探讨可控微结构EBM钛合金支架作为成骨细胞体外培养载体的可行性，并观察载体类蜂巢状孔结构在成骨细胞培养中的作用。[方法]应用直接金属快速成形技术—电子束熔化成形(electron beam melting，EBM)过程直接构建和制备可控性微结构钛合金支架。分离培养1 d龄胎兔颅骨成骨细胞，以兔颅骨源性成骨细胞复合支架作为实验组，以单独培养的兔颅骨源性成骨细胞作为对照组。将成骨细胞与支架复合培养1、7、14 d后，进行倒置相差显微镜、扫描电镜及组织切片染色观察细胞与材料复合情况，以MTT比色法及碱性磷酸酶的定量检测研究材料结构对细胞增殖、分化的影响。[结果]成骨细胞/支架复合培养7 d后，大量细胞通过伸出多个伪足粘附在支架表面以及孔周围并与支架牢固结合;培养14 d后支架表面及孔隙内有大量细胞分布，细胞伸出数个突起沿着孔隙壁逐渐向孔隙内延伸、汇集。支架上的细胞增殖、分化以及转移明显增加，与对照组比较有明显统计学差异(P<0.05)。 [结论]EBM钛合金支架有利于细胞的贴附、生长及增殖，并对细胞的功能无不良的影响。支架类蜂巢状孔结构能够调节成骨细胞在支架内的分布。

【关键词】 组织工程; 支架; 钛合金; 多孔结构

Abstract：[Objective]To explore the feasibility of culturing osteoblast on titanium alloy scaffold with controlled internal structure fabricated using electron beam melting techniques in vitro and to investigate the effects of likehoneycomb scaffold with controlled porous structure.[Method]A direct metal rapid prototyping(RP) fabrication technique，electron beam melting (EBM) process，was utilized to fabricate porous titanium alloy scaffold with fully interconnected and controlled internal pore structure.Osteoblasts were isolated from rabbit skulls，seeded on scaffolds，and cultured for up to 1，7 and 14 days respectively.The experiment was pided into experiment group(cells cultured with scaffold) and control group (cells alone ).The growth of rabbit osteoblast on the scaffolds was observed by inverted phase contrast microscope，scanning electron microscope，and histological section staining method.Proliferation and differentiation of osteoblasts were determined at different time points by MTT assay and the activity of alkaline phosphatase.[Result]The results showed the osteoblasts on scaffolds grew well in vitro with biological and morphological characteristics similar to those of normal osteoblasts.Good adhension，proliferation and differentiation of the osteoblasts on the scaffold were noted with the culture time prolonged.The number of cells on scaffolds was higher than the control group (P<0.05).[Conclusion]The porous scaffold not only has good biocompatibility，but also improved the adhesion，growth and proliferation of osteoblasts，showing no adverse effects on the cell functions.The controlled likehoneycomb pore structure can adjust the distribution of osteoblasts on the scaffolds.

Key words：tissue engineering; scaffold; titanium alloy; porous structure

金属材料广泛的应用于骨科和牙科移植物，因其与天然材料、高分子材料、无机材料及它们的复合材料相比具有较高的机械特性和延展特性而应用于承重部位骨缺损的修复和重建。近几年，可控的三维多孔金属支架结构的潜在研究引起了组织工程研究者的关注，例如钛金属[1、2]、钽金属[3]等。然而在众多金属生物材料之中，钛金属因其具有良好的机械特性、生物相容性、生物安全性、良好的抗腐蚀性能等而被广泛的应用。我们利用快速成形制造技术和电子束熔化成形技术设计并制备可控性微结构钛合金支架，通过对支架与成骨细胞的生物相容性进行评价来探讨该支架作为成骨细胞载体的可行性，以及载体微结构在培养中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂和仪器

健康1 d龄新西兰大白胎兔2 只，体重及雌雄不限，由第四军医大学实验动物中心提供;DMEM培养基(Gibco BRL公司，美国);新生牛血清(杭州四季青公司);成骨诱导培养液、磷酸对硝基苯酯ALP检测ELISA系统、对硝基苯酚、胰蛋白酶、MTT、DMSO、细胞培养瓶、培养板(Sigma公司，美国);扫描电子显微镜(HITACHI S-3000N，日本);倒置显微镜(Olympus 公司，日本);Leica SP1600锯式切片机(德国);Penguin 600CL图像采集系统(美国)。

1.2 可控性微结构EBM钛合金支架的设计与制备

支架材料由上海交通大学机械工程学院制备和提供，其制造基本原理是采用快速成形技术及电子束融化成型技术对金属的直接制造。支架是一种钛合金材料，其中铝(A1)的质量百分比为6%、钒(V)的百分比为4%、其余为钛。支架的外部形状为圆柱状，直径11.6 mm，高度5.0 mm(图1a);支架的内部形状为类蜂巢状结构，孔与孔之间彼此相互连通并且贯通于支架的外表面，孔与孔之间的连接杆宽度500 μm，支架平均孔径约为1.05 mm(图1b)。支架为孔隙率65%的均质多孔性能，体积重量比为4.42 g/cm3，抗压强度为110 MPa，弹性模量为2.7 GPa。支架在使用前经高温高压蒸汽灭菌处理。

1.3 细胞的分离与扩增

基础培养液为DMEM高糖培养基，含体积百分比为10%的新生牛血清、青霉素(100 u/ml) 、链霉素(100 u/ml);成骨诱导培养液为基础培养液中加入β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)、地塞米松(10 nmol/L)、L-抗坏血酸(50 μg/L)。采用改良的胰蛋白酶消化-组织块法[4]分离、扩增兔成骨细胞。取1 d龄新生新西兰白兔，雌雄及体质量不限，清洁饲养，取颅骨，去除结缔组织，PBS冲洗，切成1～2 mm2大小组织块，经质量百分比为0.25%的胰蛋白酶37 ℃下消化10～15 min后排列于培养瓶底，倒置培养4 h后翻转培养瓶，添加基础培养液，隔2 d换液，细胞汇合后传代。细胞传至第3代以备用。

1.4 细胞接种与培养

支架经洗涤，高温高压消毒，烘干后放入24孔培养板内，添加基础培养液(含10%新生牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml链霉素、2.5 ug/ml的两性霉素B)至浸没支架，放置于5%CO2、37℃的培养箱内孵育24 h后吸尽培养液，将第3代成骨细胞制成1×106/ml悬液，按支架孔隙容积分3次并间隔5 min滴入支架顶面。培养箱内孵育2 h后，每孔添加2 ml基础培养液，24 h后换用诱导培养液，隔2 d换液。

1.5 检测指标

1.5.1 形态学观察 倒置相差显微镜下观察成骨细胞形态变化。

1.5.2 兔颅骨成骨细胞的鉴定 采用改良Gomori钙-钴法进行细胞内ALP染色以鉴定成骨细胞，将第3代成骨细胞以1×106个/孔的密度接种6孔板中，取培养7、14 d的细胞爬片，10%中性甲醛固定15 min，改良Gomori钙-钴法染色观察。以蒸馏水替代底物β-甘油磷酸钠的孵育液为空白对照。

1.5.3 MTT法检测细胞增殖活性 细胞接种及培养1、7、14 d后每组取出5个孔，按照2 ml/孔加入MTT溶液(5 mg/ml)，37℃继续孵育4 h后终止培养并吸弃孔内培养上清液。加入DMSO 2 ml/孔，震荡20 min，使紫蓝色结晶物充分溶解。溶液按照100 ul/孔加入96孔板，每个样品6孔。用酶联检测仪在490 nm波长处检测各孔吸光度值(A)，重复检测3遍，取6孔的均值代表一个样本的A值。同时以细胞直接接种于培养板底部作为对照，结果进行统计学分析。

1.5.4 扫描电子显微镜(SEM)观察 细胞支架复合物分别培养1、7、14 d后，经PBS冲洗，支架经3%戊二醛溶液4℃下固定24 h、PBS冲洗、梯度乙醇溶液(80%～100%)脱水、真空干燥、喷金处理后于SEM下观察并拍摄照片。

1.5.5 细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)活性定量检测 细胞悬液计数后按1×106 /孔接种于96孔板中，每个样本接种6孔。加人体积百分比为1% 的Trit0nX-100 4℃过夜裂解细胞，使ALP进入溶液中。ALP检测：采用磷酸对硝基苯酯ALP检测ELISA系统，以从1 000 μmol/L原溶液中倍比稀释得到的浓度为0～250 μmol/L对硝基苯酚为标准底物绘制标准曲线，主要步骤：取80 μL检测样品或标准底物，加入96孔板内，再加入120 μL磷酸对硝基苯酯;室温下避光孵育30 min后每孔加入NaOH 50 μl终止反应。酶标仪405 nm波长检测各孔吸光度值(A值)，每孔样本重复检测3次后计算平均A值，并根据标准曲线换算为单个细胞ALP含量。

1.5.6 组织学染色和观察 支架经10%甲醛常温固定7 d后，梯度乙醇(80%～100%)脱水、二甲苯透明后用甲基丙烯酸甲酯(MMA)包埋。包埋块用Leica SP 1600锯式切片机沿支架的冠状轴切片，切片厚度为150 μm，将切片研磨至50 μm，再经三氧化二铝粉(3 μm)抛光后，全部切片均行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin stain，HE)染色、显微镜观察、图像采集系统取图。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0 统计软件包进行分析。数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析和t 检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 成骨细胞形态学观察及鉴定

采用改良的酶消化-组织块法培养的兔成骨细胞，组织块贴壁6 d后成骨细胞自骨块边缘爬出(图2a)，培养10 d后传代，传代第3 d时，细胞呈贴壁生长，主要为梭行或多角型并带有数个突起(图2b);传代第6 d时，细胞融合成片，分界变得较为模糊，胞体增大并呈层叠生长而不出现接触抑制现象。

改良Gomori钙-钴法检测显示：原代细胞培养的前5 d，ALP 染色阳性率较低，当细胞逐渐融合后ALP活性增强。取70%～80%融合的原代、1 、2 代细胞，经改良Gomori钙-钴法染色，大部分细胞呈阳性，表现为细胞胞浆内可见灰、黑色颗粒(图2c)，而空白对照组呈阴性。

图1a 支架大体照片 (×5) 图1b 支架扫描电镜图像(×20) 图2 1 d龄胎兔原代、第2代成骨细胞形态学观察及其鉴定(倒置相差显微镜×50) 图2a 原代细胞培养第4 d 图2b 第2代细胞培养第2 d 图2c 第2代细胞ALP染色

2.2 细胞活力测定

细胞活力代表了粘附在支架上的活细胞数量，可间接反映细胞增殖情况。本实验中将细胞活力表达为单位质量的(g)支架的A值。随着培养时间的延长，两组A值均升高，相同时间点两组细胞增殖统计比较，1 d组无统计学差异(P>0.05)，7、14 d组有显著差异(P<0.05)，有统计学意义;分别比较对照组和实验组各时间点的差别，有统计学差异(P<0.05)。结果表明支架对成骨细胞增殖有促进作用。结果见表1。表1 两组各时间点细胞增殖MTT法检测结果

2.3 SEM观察

镜下：细胞支架复合物培养1 d后，在材料表面可见一些形态多样(以梭形和多角形为主)单层结构的细胞，细胞伸出数个伪足附着于材料内壁，细胞贴附良好但尚未完全伸展，同时在孔洞中也有部分细胞生长(图3a)。培养7 d后，大量的扁平状细胞通过伸出多个伪足贴附于支架表面及孔壁并与材料牢固结合，细胞在支架表面及孔内壁完全伸展，几乎覆盖所有的材料内壁表面，细胞间排列紧密，可见相邻细胞的间隔及细胞分泌的絮状细胞外基质(图3b)。随着培养时间的延长，培养14 d后，细胞为多层结构，支架表面覆盖有密集排列、汇合生长的细胞层并向支架内部移行，拨开细胞层，能看到部分细胞覆盖支架孔;支架内部，细胞贴附管道内壁生长且成骨细胞跨越微孔表面呈方向性密集排列并向孔隙内分裂增殖。在支架的内表面，细胞从一个孔贯穿到另一个孔(图3c)。支架表面及内部的细胞形态、密度基本一致。

2.4 ALP活性检测

随着培养时间的延长，细胞ALP含量升高，实验组培养1 d后略高于对照组，差异无统计学意义(P>0.05);实验组培养7、14 d后ALP含量显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。表2 不同时间两组单个细胞ALP含量* 与对照组比较P< 0.05

2.5 组织学观察

细胞支架复合物体外培养1 d后，低倍镜下不容易观察到细胞，仅能看见少量细胞聚集形成的轮廓贴附在支架边缘;高倍镜下可见成骨细胞多呈单层结构，扁平型或梭形，核圆，着色深蓝，排列稀疏，细胞单个或聚集成一小簇粘附在支架的表面，与支架表面贴附良好(图4a);随着培养时间的延长，细胞支架复合物体外培养7 d后，成骨细胞出现明显的分层生长，细胞与支架表面牢固结合，在支架周围进行增殖，并向孔隙内延伸(图4b);培养14 d后，细胞数量明显增多，呈多层结构，以支架表面为支撑点，在孔隙附近连接成片向微孔内成簇生长(图4c)。

图3 细胞与支架体外复合培养1、7、14 d扫描电镜观察(×50) 图3a 复合培养1 d 图3b 复合培养7 d 图3c 复合培养14 d 图4 支架与细胞体外培养1、7、14 d硬组织切片 HE染色(×200)

3 讨 论

关于骨科金属支架的最主要的问题是骨组织和大块金属生物材料之间的弹性模量的不匹配，由于机械特性的不匹配致使骨组织不能充分的填充而产生应力屏蔽，由于应力屏蔽的存在致使在移植材料和骨组织之间产生机械特性不匹配，从而导致较低的界面粘合强度和松弛的界面。克服这种缺点的方法是应用多孔金属材料，许多研究者致力于研究多孔金属作为移植材料，它提供了一个可以调整的机械特性和为骨组织向内生长的三维互联的孔隙结构。已有研究发现，多孔支架的三维结构包括孔径、孔形态、孔间连接方式等对于细胞的迁移、分布、生长以及新生组织的形成等均具有重要作用。这样，极大的改善了支架表面相容性和机械特性相容性。虽然传统的方法包括相分离、发泡法、粒子沥滤等可以制造出各种孔隙的多孔支架，但是，这些方法缺乏对孔结构(如孔的尺寸、空间走向、连通性等)的控制，更缺乏制造复杂外形的能力[5～7]。常常不能满足上述骨移植物的条件。近年来，快速成形技术的广泛应用，不但可以实现植入体复杂外形的加工制造，而且还能够精确控制植入体的内部孔隙结构，包括孔的尺寸、形状、空间走向、连通性等。但是，许多研究者把应用快速成形技术的注意力主要集中在研究聚合物和陶瓷材料上[7～9]，而对于能够精确控制孔结构的钛支架却很少有报道，最近，Garrett E等[10]、Li等[11]应用快速成形技术成功的制造出了三维多孔的钛支架，然而上述过程并不是金属直接形成过程，应用快速成形技术对多孔金属支架的直接构建技术是一种非常有前景的技术。

本实验研究通过应用电子束融化快速成形技术成功的实施了对多孔钛合金支架的直接构建。支架类似于正常人松质骨的弹性模量(2.7 GPa)，避免了支架和骨组织之间的应力屏蔽;良好的抗压强度(110 MPa)为承重部位的骨缺损的修复和重建提供了一个良好的力学性能支撑;其65%的均质多孔性能和约为1.05 mm的孔径，符合组织工程支架的设计，孔径的误差考虑到将来支架的收缩和在表面涂层，故所设计的支架孔径大小比骨组织向支架内长入的理想孔径大小要大。另外，支架可以精确控制的宏观结构(类蜂巢状结构)和微观结构(如孔尺寸、形状、空间走向、连通性等)获得了传统制备方法不可比拟的优势，为细胞、毛细血管、骨组织的长入以及体内营养的均匀供给提供了一个良好的载体。

本实验应用MTT法、扫描电镜、组织切片染色、ALP活性定量检测等方法探讨了上述优化技术设计出的钛合金支架作为成骨细胞体外培养载体的可行性，以及观察由这种设计方法设计出的类蜂巢状孔结构支架在培养中的作用。MTT法测定以及ALP活性定量检测结果显示，实验组细胞数量和活性随着培养时间的延长而明显增加，与对照组比较差异显著(P<0.05)，这充分表明支架对成骨细胞没有抑制作用，反而细胞数量及活性明显增加。考虑其原因为:(1)支架与细胞具有良好的相容性，支架具有一定的促进细胞黏附、增殖和分化的特性; (2)细胞在三维类蜂巢状多孔材料中较平面培养以及其他形状的支架对营养的接触吸收及代谢产物的排出更为有利。其具体机理还有待于进一步研究。扫描电镜观察结果证实：随着培养时间的延长，细胞由单层结构变为多层结构并且细胞由支架表面逐渐向支架内部延伸并贯穿孔与孔之间，表明细胞已均匀分布于整个支架内部，证明了支架与成骨细胞良好的组织相容性，同时观察显示，支架表面及内部浅层、中心管道内细胞形态、密度基本一致，证明相互连通的管道结构以及类蜂巢状孔隙结构是引导均匀有序的营养供应和细胞分布的结构基础，为成骨细胞的粘附、增殖、分化以及移动提供了非常有利的条件。组织切片染色进一步的证实，随着培养时间的延长，细胞能够在支架上很好的粘附、增殖、分化，并逐渐向支架孔隙内伸展，这说明支架能够很好的作为细胞的载体而促进细胞的增长，并且细胞在支架表面、内部孔壁甚至孔隙内部均有生长，说明类蜂巢状孔隙结构在其中扮演了重要的角色，它为细胞生长、孔与孔之间的相互细胞连接以及进一步的组织相互连接提供了一个良好的载体微孔结构。

综上所述，本实验利用电子束融化快速成形技术成功的制备了多孔钛合金支架。同时，通过对支架生物活性检测进一步证实了支架具有良好的生物相容性，不仅能够作为成骨细胞体外共培养的载体，而且还将进一步成为血管以及骨组织的长入的良好载体。其类蜂巢状多孔结构在支架内实现均匀的营养供给，促进了细胞增殖、分化及在支架内的均匀分布。因此多孔钛合金支架良好的物理学行为和生物学特性为临床修复承重部位骨缺损提供了一种很有前景的选择方法并为今后组织工程支架的制备及相关应用研究提供了可能。