载万古霉素PDLLA钛合金钢板的毒性试验评估

作者：唐良华，赵长虹，王爱民

【摘要】 目的 检测载万古霉素（VCM）聚DL乳酸（PDLLA）的抗感染骨折内固定钛合金钢板的生物安全性。方法 以PDLLA为载体，采用溶剂浇铸（solvent casting）技术，在钛合金板基体表面制备了携载VCM的PDLLA涂层，通过全身急性毒性试验、热原试验、溶血试验、局部刺激试验、骨髓微核试验等来检测其生物安全性。结果 钢板表面获得的载VCMPDLLA涂层经试验证实对动物无明显毒性反应。结论 载VCMPDLLA钛钢板具有良好的生物安全性。

【关键词】 万古霉素；聚DL乳酸；钛合金；涂层

Abstract： Objective To evaluate the biological safety of an internal fixation plate which can inhibit infection by carrying and slowreleasing Vancomycin.Methods PDLLA coating with Vancomycin was prepared on the surface of titanium plate by solvent casting technology with the PDLLA as a carrier；the biological safety of VancomycinPDLLA loaded plates was tested by acute systemic toxicity test，hemolytic test，pyrogen test，et al.Results There was no toxicity for the VancomycinPDLLA loaded antibacterial titanium alloy plates.Conclusion There is a good biocompatibility for the VancomycinPDLLA loaded antibacterial titanium alloy plates.

Key words:vancomycin；PDLLA；titanium alloy；coating

临床上骨科内固定手术后，由于感染导致内固定失败，或者因为感染后形成的具有高抗药性的生物膜，即使全身应用大剂量抗生素，在病灶局部组织中亦难以达到有效的抗生素浓度，导致感染久治难愈，最终不得不取出内固定，若能在内固定物的表面搭载抗生素，从而直接在病灶局部直接释放出高抗菌浓度的抗生素，获得较全身大剂量使用抗生素更有效的浓度，以最大限度地杀灭局部病菌，同时减少病菌耐药性的出现，解决常规用药方式效率不高且毒性较大这一问题。近30年来在一系列新的生物相容性较好的无机材料和有机高分子材料基础上逐渐发展起来的新型局部给药方式——抗生素缓释系统，在治疗骨髓炎、骨结核和感染性骨缺损等方面有着广阔的应用前景［1-4］。聚DL乳酸(PDLLA)材料是一类在生物体内能发生降解，其降解产物是乳酸，该物质是人体新陈代谢过程中一种代谢产物。由于PDLLA具有良好的生物相容性和可降解吸收性［5，6］，若能将其与内固定材料及抗生素结合起来，制作出抗生素缓释系统，则使局部用药治疗感染的效果能够得到大大提高。本文以具有良好生物相容性和可降解性的PDLLA为载体，采用溶剂浇铸的方法，在钛合金植入物表面制备了携载万古霉素（VCM）的PDLLA的抗感染涂层。但应用于临床必须要具有良好的生物相容性，无明显毒性反应，本部分通过动物体内及体外试验对载VCMPDLLA钛钢板的生物安全性进行初步评价。

材料与方法

1 材料及制备

1 材料、试剂与动物 医用钛合金钢板（第三军医大学大坪医院提供），切割为15 mm×10mm×5mm的立方体；盐酸万古霉素（商品名为稳可信，Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories生产）；聚乳酸（DL型，分子量MW=58000Da，中国四川迪康医药有限公司生产）；所有试验试剂（如乙酸乙酯、丙酮、乙醇等）均为分析纯。

健康昆明纯系小白鼠，新西兰大白兔均由第三军医大学大坪医院野战外科研究所试验动物中心提供。

1.2 载VCM钢板涂层的制备 采用solvent casting技术［7］，将钛板用400、600#金相砂纸打磨后依次用丙酮、70%乙醇和蒸馏水超声清洗各10分钟，晾干后浸入98%H2SO4+30%H2O2(体积比7：3)的混合溶液中1小时，取出，蒸馏水充分清洗后，40℃烘干，消毒备用。精确称取PDLLA 2.0g，充分溶解于40ml乙酸乙酯中，然后加入VCM 0.1g，超声振荡，形成5%的分散均匀的混合溶液。将上述处理后的钢板浸没于配制的混合溶液中5分钟，取出，静置10分钟晾干后再次浸入，重复3次。然后取出，室温下过夜干燥，溶剂挥发后即得到载VCMPDLLA钛合金钢板。环氧乙烷消毒备用。

1.3 浸提液的制备 载VCMPDLLA钛合金钢板经环氧乙烷消毒后，无菌条件下，将其放入无菌三角瓶内，在37℃水浴箱中用生理盐水持续浸泡72小时 （材料重量与浸提递质容量的比例为1g：5ml），制备材料浸提液。

2 试验方法

2.1 全身急性毒性试验 选用健康小白鼠10只，雌雄各半，体重17～23g。将小鼠随机分试验组和对照组2组，每组5只。试验组小鼠腹腔注射材料浸提液，每只小鼠注射剂量为50ml/kg；对照组腹腔注射无菌生理盐水50ml/kg，于注射后即刻及24、48、72小时观察和记录实验组和对照组小鼠一般状态、毒性表现和死亡动物数（观察指标见表1［8］）。于注射前及注射后24、48、72小时称重并记录两组小鼠的体重变化。表1 注射后小鼠反应观察指标

程度症状无毒未见毒性症状轻度毒性有呼吸困难或腹部刺激轻度症状，但无运动减少 中度毒性呼吸困难，腹部刺激症状，运动减少，眼睑下垂，腹泻，体重降至15～17g重度毒性衰竭，发绀，震颤，严重腹部刺激症状，呼吸困难，眼睑下垂，体重降至15g以下 死亡注射后死亡

2.2 热原试验 选用新西兰大白兔5只，雌雄不限，体重2.2～2.5kg。试验前1周挑选健康新西兰大白兔5只，雌雄不限，体重2.2～2.5kg，体温均在38.0～39.6℃之间，随机编为1～5号，测体温时用精确肛温计插入家兔肛门约6cm左右，测温时间1.5分钟；测温前1周用同种饲料喂养，精神、食欲、排泄等无异常，体重无减轻。7天后在同样室温和温度下正式试验，每隔30分钟测量体温1次，共测3次。取其平均值作为正常体温。然后分别自耳缘静脉静推温度为38℃的材料浸提液（10ml/kg）。注射后每隔1小时测量体温1次，共3次，3次体温中最高的1次减去正常体温即为试验兔体温升高值。若升高值<1.4℃说明没有致热源物质存在。

2.3 溶血试验 抽取健康新西兰大白兔静脉血10ml，加入2%草酸钾0.5ml，取此兔血8ml加入生理盐水10ml进行稀释即制备出新鲜稀释兔血。将试验组（样品浸提液）、阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（双蒸水）试液10ml分别置于50ml三角瓶中，每组各设3个三角瓶，置于37℃水浴中30分钟。然后在各瓶中加入新鲜稀释兔血0.2ml轻轻摇匀，在37℃水浴中继续保存60分钟，以2000r/min×5分钟将所有试管离心，取上清，用BioSpecmini紫外分光光度计（SHIMADZU日本）于波长545nm测吸光度，试验组和对照组吸光度均取3瓶平均值。溶血程度用溶血率(%)表示，按下式计算，溶血率(％)=［(试验样品的吸光度值一阴性对照的吸光度值)/(阳性对照的吸光度值一阴性对照的吸光度值)］×100％。若试验组溶血率>5%为阳性反应，表示有溶血现象。

2.4 局部刺激试验

2.4.1 皮内注射刺激试验 3只新西兰大白兔脱毛备皮，分别在每只兔左后大腿外侧皮内注射0.1ml材料浸提液，右后大腿外侧注射等量生理盐水。分别于注射后1、24、48、72小时观察并记录注射部位皮肤及周围组织有无局部红肿等刺激反应。

2.4.2 原发性皮肤刺激试验 3只新西兰大白兔脱毛备皮，并在每只兔双侧后腿及左前腿外侧各划#形损伤伤口(面积约3cm×3cm)，在所有兔左前腿外侧创面各自涂敷0.1ml浸提液，兔左后腿外侧伤口涂敷甲醛0.1ml为阳性对照，兔右后腿外侧伤口涂敷0.1ml生理盐水为阴性对照，用消毒纱布覆盖，24小时后移去斑贴物，观察1、24、48、72小时并记录受试物对兔破损皮肤有无刺激作用。

3 统计学处理

所有数据采用SPSS软件13.0进行分析。正态分布计数资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对资料t检验，P<0.05为差异显著。

结 果

1 全身急性毒性试验

在72小时观察期内，对照组和试验组小鼠一般情况良好，活动、食欲正常，呼吸平稳，无惊厥、腹泻、瘫痪和死亡等毒性反应，体重渐增（见表2），符合GB/T16886．111997的规定。

2 热原试验

5只新西兰大白兔体温升高值<1.4℃（见表3），说明该样品符合热原检查的规定。

3 溶血试验

按照每组测定值的平均吸光度值计算得溶血率为2.41%（见表4），溶血率<5%，即说明该材料无明显的溶血反应存在。符合规定≤5%的标准。

4 局部刺激试验

皮内注射刺激试验观察1～72小时，试验侧注射点与对照侧注射点均无明显刺激反应；原发性皮肤刺激试验观察1～72小时，试验侧与阴性对照侧注射点均无明显刺激反应，但阳性对照侧皮肤于1～24小时逐渐出现轻微红斑、水肿，于48小时出现明显红斑及水肿，于72小时出现焦痂。证明该材料局部刺激试验合格，符合生物材料的要求。表2 对照组和实验组小鼠体重变化记录表4 溶血试验结果

讨 论

载抗生素内植入物是指在不改变普通内植入物原有物理性能、化学特征的基础上，将抗生素与生物材料如PDLLA或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）聚合后喷涂在内植入物表面使用，或将抗生素与内植入物如骨水泥聚合后使用，从而使普通内植入物具有了抗菌性能，此种抗菌性能可以采用缓释系统逐渐将抗生素释放出来，当有细菌侵入或者发生感染时，释放出来的抗生素就会杀灭细菌，从而起到抗菌的作用。生物相容性是生物医用材料与人体之间相互作用产生各种复杂的生物、物理、化学反应的一种概念。当载抗生素内植入物表面与组织、血液、细胞等短期或长期接触时，材料与机体之间的相互作用使各自的功能和性质受到影响。因此在生物医学方面要求载抗生素内植入物应该对人体无毒性、无热原反应、无溶血反应和无刺激性等，对人体组织、血液等不产生不良作用。

本试验选用的VCM属于糖肽类抗生素，直接作用于细菌细胞壁前体羧基末端的D丙酰胺D丙氨酸（DAlaDAla），抑制细胞壁蛋白的合成，对革兰氏阳性菌有强效的杀灭作用，是治疗耐甲氧西林表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金葡菌感染的特效药物。由于其全身引用会造成较严重的肝、肾等重要脏器的损害，因此被认为是较理想的的局部应用的抗生素之一；而PDLLA具有良好的生物相容性、可降解吸收性、良好的力学稳定性和良好的的成骨诱导性，它在植入物表面通过水解作用从而降解需要3～6个月时间，最终降解产物是CO2和H2O，中间代谢产物乳酸也是体内正常糖代谢产物，其降解产物最终通过柠檬酸循环而代谢，因此在体内不会对人体产生明显的不良影响［5，6，9］。而钛合金钢板具有良好的与人体骨骼接近的弹性模量，钛无毒、质轻、强度高且具有优良的生物相容性，是非常理想的医用金属材料，可用作植入人体的植入物等。由于以上的这些优点，将PDLLA和VCM结合起来，以solvent casting技术制作成涂层贴附在钛合金钢板上，通过PDLLA的逐渐降解和VCM的逐渐释放，起到在局部达到有效的抗菌浓度，从而直接杀灭病原菌的作用。

对于体内长期植入的材料， 根据国际标准化组织（ISO）的规定， 须进行生物相容性评价。VCM和PDLLA虽然具有良好的生物相容性，但是当两者以乙酸乙酯为溶剂，在钢板表面形成的抗感染生物涂层是否具有毒性，还需要实验验证。故本试验参考医疗器械生物学评价标准进行评估［10-13］。急性毒性试验是一种特异急性毒性试验，本试验的结果显示载VCMPDLLA钛钢板材料浸提液对试验动物未产生任何毒性反应， 更未影响到动物的生存；热原试验能够全面的检出内毒素所致或非内毒素所致的热原物质，热原物质进入人体超过一定限量后，会发生热原反应，引起患者发热，严重的会造成死亡，本试验结果显示每只新西兰大白兔体温升高值均<0.4 ℃，符合热源试验体温升高值<1.4℃的要求；溶血试验是细胞毒性评价的一个补充性的、而且比较灵敏的试验，溶血试验的结果显示溶血率为2.41%， 符合医用材料的溶血率≤5%的要求；局部刺激试验的结果说明载VCMPDLLA钛钢板无皮肤刺激作用。

通过以上系列试验说明载VCMPDLLA钛合金钢板具有良好的生物安全性，是一种无毒、无刺激性、不含热原物质，有良好血液相容性的骨内固定材料，可做为一种安全的骨植入材料进行动物及临床试验。同时其细胞毒性等其他一些生物相容性评估还需要进一步研究。