氯化两面针碱体外诱导人口腔鳞癌KB细胞G2/M期阻滞及凋亡的研究

作者：刘华钢 王博龙 秦三海 杨斌

【摘要】 目的探讨氯化两面针碱对人口腔鳞癌KB细胞周期和凋亡的影响及相互关系。方法应用MTT比色法测定氯化两面针碱对细胞增殖的抑制作用；流式细胞术（FCM）检测氯化两面针碱对细胞周期的影响；Hoechst33258检测细胞凋亡；透射电镜观察细胞超微结构。结果氯化两面针碱在体外呈浓度依赖性显著抑制KB细胞的生长，48 h IC50为（2.36±0.22）μg/ml；与空白组相比，经3μg/ml氯化两面针碱作用， G2/M期细胞比例显著增多；6 μg/ml时凋亡细胞比例最高，可见典型的核染色质凝集、碎裂；9 μg/ml时，细胞凋亡率明显下降，同时镜下可见大量坏死细胞。结论 氯化两面针碱抗KB细胞的方式与其剂量密切相关，低浓度时以G2/M期阻滞为主，中浓度时诱导凋亡，高浓度时则致其坏死。

【关键词】 氯化两面针碱 G2/M期阻滞 凋亡 坏死 KB细胞

Abstract：ObjectiveTo explore the influence of nitidine chloride on cell cycle and apoptosis of human carcinoma of mouth floor KB cells and their relationship.MethodsThe proliferation inhibition rate and IC50(48 h) of nitidine chloride to KB cells were examined by MTT assay. The influence of nitidine chloride on cell cycle was measured by flow cytometry. Hoechst33258 technology was adopted to detect cell apoptosis. Transmission electron microscope was used to observe cell ultrastructure.ResultsNitidine chloride markedly suppressed proliferation of KB cells in a dose-dependent manner in vitro， IC50 for 48h was （2.36±0.22）μg/ml. Compared with control group， after treated with 3μg/ml of nitidine chloride，the percentage of G2/M phase cells significantly increased.The highest apoptotic percentage and typical nuclear chromatine condensation and fragmentation were observed at the nitidine chloride concentration of 6 μg/ml.When KB cells were treated with nitidine chloride of 9 μg/ml，cell apoptosis rate significantly decreased ， many necrotic cells were seen under transmission electron microscope at the same time. ConclusionThe means of nitidine chloride inhibiting KB cells is closely associated with its dose，nitidine chloride induced G2/M phase arrest at low concentration， induced apoptosis at medium concentration and lead to necrosis at high concentration.

Key words：Nitidine chloride； G2/M phase arrest； Apoptosis； Necrosis； KB cells 细胞凋亡是当前肿瘤研究中的热点，诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗肿瘤药物发挥效应的重要途径。氯化两面针碱是我国学者黄治勋等［1］从两面针Zanthoxylum nitidum (Roxb)DC.植物的根中分离到的具有抗肿瘤活性的生物碱，与其抗肿瘤活性相关的研究多集中在药效方面，为数甚少的抗肿瘤机制研究尚在争论之中［2］，樊亦军等［3］初步报道了其具有G2/M期阻滞效应。氯化两面针碱能否诱导肿瘤细胞凋亡尚未见报道，我们以人口腔鳞癌细胞KB为研究对象，系统研究了氯化两面针碱对人口腔鳞癌KB细胞周期和凋亡的影响及相互关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂氯化两面针碱购自中国药品生物制品检定所(批号11084820001，纯度>98%)；胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)购于AMRESCO公司；RPMI1640培养基购于美国GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司；Hoechst33258购自北京普利莱基因技术有限公司； RNase购自MBI；PI：Sigma。

1.2 仪器EpicsXL II型流式细胞仪为美国Beckman Coulter公司产品，使用Muticycle AV分析软件；酶联免疫检测仪Model450：BioRad ，USA；荧光显微镜：LeicaDMR+Q550，Germany；JEM1200EX型透射电镜；CO2培养箱：Forma scientific Inc。

1.3 细胞培养 人口腔鳞癌细胞KB购自中国科学院细胞库，置37℃，5%CO2的培养箱中，用含10%新生牛血清以及青链霉素各100 U/ml的RPMI1640培养液培养。倒置显微镜观察细胞生长情况，0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 MTT法检测细胞存活率 将氯化两面针碱用DMSO助溶，用基础培养基依次对半稀释成五个梯度的母液，调整各浓度中DMSO含量至一致。取对数生长期细胞，以每孔0.19 ml（约0.3×104个/孔）接种于96孔板，培养12 h待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的氯化两面针碱10 μl，使其终浓度分别为12，6，3，1.5，0.75 μg/ml，对照组加含等浓度DMSO的基础培养基。每个梯度设4个复孔，其中DMSO终浓度为0.5%，孵育48 h每孔加入10 μl MTT（5mg/ml），继续培养4 h后倾去培养液，加入DMSO 0.15 ml/孔，平板震荡器振荡5 min，充分溶解蓝紫色颗粒，空白孔调零，用酶标仪以570 nm/630 nm双波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值，实验重复3次，Bliss法计算IC50。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期 收集3 μg/ml氯化两面针碱处理0，12，24，48 h的细胞，PBS冲洗2次，用70%乙醇4℃固定过夜，PBS洗涤离心去上清，加入适量含100 mg/L RNaseA和50mg/L PI的染液，调整细胞浓度到1×105个/ml左右，4℃避光染色30 min，上流式细胞仪检测。激发波长为488 nm，用MultiCycle AV软件进行细胞周期分析，以计算各期细胞百分率。

1.6 Hoechst33258检测细胞凋亡 Hoechst33258为透膜性荧光染料，可与细胞核DNA结合，故正常细胞和凋亡细胞均可被Hoechst33258着色，但是正常细胞核的Hoechst着色很浅；而凋亡细胞由于细胞体积缩小，染色质固缩浓集、碎裂而呈浓染致密的亮蓝色颗粒状荧光，故用Hoechst33258可以准确地标记出凋亡细胞。收集0，3，6，9 μg/ml的氯化两面针碱作用48h后的细胞，用PBS洗涤，低速离心去上清，加入0.5 ml 4%的多聚甲醛重悬细胞后4℃过夜，去固定液，PBS洗涤离心，用稀释100倍的Hoechst33258染液重悬细胞。室温孵育10 min，离心去染色液，用PBS洗涤离心，适量PBS重悬细胞后涂片，荧光显微镜下观察，每组观察3张片子，每片观察3个视野，统计每个视野100个细胞的凋亡率。

1.7 透射电镜观察细胞超微结构变化 氯化两面针碱处理细胞同“1.6”项方法，消化离心去上清，加入10%牛血清蛋白100 μl重悬，再次离心，吸去多余牛血清蛋白，加适量4℃预冷的2.5%戊二醛固定，经1%四氧化锇预固定和后固定后，酒精及丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，作0.5 μm薄切片，醋酸双氧铀及构椽酸铅染色，JEM-1200EX型透射电镜观察、照相。

1.8 统计学处理样本均数间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD法，数据用±s表示，P<0.05为有统计学差异，统计学处理均使用SPSS13.0统计软件进行处理。

2 结果

2.1 对细胞增殖的影响 如图1所示，氯化两面针碱对KB细胞生长呈剂量依赖性抑制，随着药物浓度的增加，细胞存活率越来越低，48hIC50为（2.36±0.22）μg/ml，提示氯化两面针碱在体外具有抗KB细胞增殖的作用。

图1 氯化两面针碱对细胞增殖的抑制作用(n=3)（略）

2.2 氯化两面针碱对细胞周期的影响 从图2可以看出，经3 μg/ml氯化两面针碱作用KB细胞12 h后，细胞周期分布就呈现明显变化，即G0/G1期和S期细胞所占比例较未用药组均明显下降（P<0.01），G2/M期细胞比例（52.4±2.2%）显著增加，与未用药组（10.5±2.5%）相比有显著的统计学差异（P<0.01）。到48h时G2/M期细胞比例高达（72.7±2.2）%，然而与氯化两面针碱作用24 h时的（70.2±2.1）%相比，G2/M期细胞比例无显著性差异(P＞0.05)。这表明氯化两面针碱对KB细胞有着明显G2/M期阻滞效应，其阻滞作用高峰在48 h之前。

图2 流式仪周期图（略）

2.3 氯化两面针碱对细胞凋亡的影响如图3所示，空白对照组细胞胞核染色很浅，轮廓不清。经不同浓度氯化两面针碱作用48 h后，各组中未凋亡细胞胞核呈现弥漫均匀的浅绿色荧光，形态均一， 隐约可见；而凋亡细胞皱缩变小，大小不一，部分破裂，胞核或胞质内浓染致密的亮蓝色荧光颗粒清晰可见，有的呈现出典型的核碎裂式。统计显示，结果随药物浓度的递增，细胞凋亡率依次为(1.3±0.6)%，（2.5±0.5）%，（17±3）%，（9.5±2.3）%，其中与空白组相比有统计学差异的为6 μg/ml组和9 μg/ml组，而6μg/ml组和9μg/ml组相比P<0.05，可见氯化两面针碱诱导KB细胞凋亡有一定的剂量范围，并非浓度越高，凋亡率越高。

图3 凋亡荧光显微镜照片（略）

2.4 氯化两面针碱对细胞超微结构的影响 电镜下空白组细胞形态清晰，细胞膜、核膜完整，胞核大，核仁多轮廓不规则，胞浆核糖体丰富，细胞表面有大量微绒毛（图 4）；3 μg/ml和6 μg/ml组可见少量坏死细胞和许多不同程度的凋亡细胞，其细胞变小，胞质浓缩，胞质内出现大量空泡，细胞核染色质高度凝聚、边集甚至碎裂解，细胞表面微绒毛消失（图 5），且6 μg/ml组凋亡细胞明显多于3 μg/ml；而在9 μg/ml组，凋亡细胞明显减少，以坏死细胞为主，细胞核核膜不完整，核浆漏出，胞质内细胞器崩解，细胞表面微绒毛消失（图 6），甚至可以看到部分细胞胞核连续电子致密带断裂、嗜锇物脱落（图 7），说明细胞核遭到了严重损伤。

图4 空白组细胞（2 800×）（略）

图5 凋亡细胞（2 800×）（略）

图6 坏死细胞Ⅰ(2 800×)（略）

图7 坏死细胞Ⅱ(2 800×)（略）

3 讨论 肿瘤是一类细胞增殖周期紊乱性疾病，也是细胞凋亡失控性疾病，细胞周期的改变和细胞凋亡的关系越来越引起人们的重视，许多中药有效成分［4～6］通过阻滞细胞周期进程，诱导细胞凋亡来发挥抗肿瘤效应。而流式细胞术能够准确客观地反映细胞的周期分布及凋亡情况，所以我们运用它来观察氯化两面针碱对人口腔鳞癌KB细胞周期和凋亡的影响。结果显示，3 μg/ml氯化两面针碱对KB细胞有着明显的G2/M期阻滞效应，且出现时间早，24 h左右达高峰，48 h未见明显增加，但代表细胞凋亡率的亚二倍体峰却在各时间点上未检到。因此，我们固定48 h的作用时间，逐渐增加氯化两面针碱的浓度，改用荧光染料Hoechst33258来检测细胞凋亡，结果3 μg/ml组凋亡率为（2.5±0.5）%，随着浓度的增加，KB细胞凋亡率开始上升，6 μg/ml时达(17±3）%，而9 μg/ml时，细胞凋亡率又跌至（9.5±2.3）%，由此我们推测氯化两面针碱诱导KB细胞凋亡可能存在一定的剂量范围，浓度低时以G2/M期阻滞效应为主，凋亡发生较少，这也许是我们流式未检出凋亡的原因，但也并非浓度越高凋亡率越高，如9 μg/ml组反而降低。 细胞凋亡时超微结构呈现典型改变，如胞质的固缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，这些特征在透射电镜下得到最佳的体现，因而透射电镜是细胞凋亡判定最直观、最可靠的依据。我们电镜结果显示，0 μg/ml和3 μg/ml组凋亡细胞均较少；6 μg/ml组里核染色质高度凝聚、边集的典型凋亡细胞显著增多，同时可见少量坏死细胞；而在9 μg/ml组，视野里可见大量坏死细胞，凋亡细胞明显减少。以上结果说明氯化两面针碱浓度过高时，抗KB细胞的方式以致其坏死为主，这也许可以解释在Hoechst33258检测法中9 μg/ml组细胞凋亡率的下跌。 综合以上分析，我们认为氯化两面针碱显著抑制KB细胞的增殖，作用方式与其浓度密切相关，低浓度时以G2/M期阻滞为主，中浓度时可诱导凋亡，高浓度时则以致其坏死为主。

【参考文献】 ［1］ 黄治勋，李志和.两面针抗肿瘤有效成分的研究［J］.化学学报，1980， 38(6)：535. ［2］ 杨洪勤，万维勤，周 耘.抗肿瘤剂氯化两面针碱在碱溶液中的反应［J］.第二军医大学学报，2000 ，21(8)：756. ［3］ 樊亦军，周 军，李 茂.氯化光花椒碱对小鼠艾氏腹水癌细胞生长周期的影响［J］.中国药理学报，1981，2(1)：46. ［4］ 朱 青，张王刚，王立锋，等.白藜芦醇诱导肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及机制［J］.第四军医大学学报，2005，26(21)：1935. ［5］ Alpana Tyagi， Chapla Agarwal， Gail Harrison， et al. Silibinin causes cell cycle arrest and apoptosis in human bladder transitional cell carcinoma cells by regulating CDKI-CDK-cyclin cascade， and caspase 3 and PARP cleavages［J］.Carcinogenesis， 2004，25（9）：1711. ［6］ Ya-Ling Hsu， Chien-Yu Cho， Po-Lin Kuo ，et al. Plumbagin (5-Hydroxy-2-methyl-1，4-naphthoquinone) Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest in A549 Cells through p53 Accumulation via c-Jun NH2-Terminal Kinase-Mediated Phosphorylation at Serine 15 in Vitro and in Vivo［J］.Pharmacol. Exp. Ther， 2006，318(8)：484.