高效液相色谱法同时测定健康人口服加味逍遥散后血清阿魏酸和芍药苷含量及其药动学研究

作者：李辉， 任平， 黄熙， 唐文富， 魏宏强

【摘要】 目的：研究高效液相色谱法(high performance liquid chromatography， HPLC)同时测定健康人口服加味逍遥散(Modified XiaoYao Decoction， MXYD)后血清中阿魏酸和芍药苷含量及其药动学。方法：水浴法预处理血样，HPLC法同时测定8名健康人在口服加味逍遥散浓缩汤剂后8个时间点各个血清样本中芍药苷与阿魏酸的血药浓度。应用3P97药动学分析软件对血药浓度时间数据进行拟合。选用香豆精为内标，芍药苷和阿魏酸检测波长分别为：0～10 min为230 nm和10～25 min为320 nm。结果：8名健康志愿者口服MXYD浓缩汤剂后，在血清中检测到芍药苷和阿魏酸。两种化合物分离完全，未出现其他物质干扰峰，保留时间(retention time， Tr)分别为8.02 min和13.32 min，内标香豆素为19.14 min。芍药苷和阿魏酸的平均回收率分别为100.9 %和95.3%，平均相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为3.4%和3.2%。用空白血清加标准品绘制标准曲线，芍药苷线性范围为40～1 280 ng/ml，信噪比为3时最低检测线为5 ng/ml，最低检测浓度为15 ng/ml（RSD=12.5%）；阿魏酸线性范围为10～320 ng/ml，最低检测线为0.65 ng/ml，最低检测浓度5 ng/ml（RSD=9.7 %）。成分日间与日内精密度及准确度在92.1%～109.9%，且RSD<5%。结论：采用高效液相色谱法对人体服用加味逍遥散后血清中的芍药苷和阿魏酸进行同步测定，适用于临床试验中血清芍药苷和阿魏酸的定性定量研究。

【关键词】 加味逍遥散; 芍药苷; 阿魏酸; 高效液相色谱; 药动学

Objective: To simultaneously determine the contents and explore the pharmacokinetics of ferulic acid and paeoniflorin by high performance liquid chromatography (HPLC) after oral administration of Modified Xiaoyao Decoction (MXYD)， a compound of traditional Chinese herbal medicine.

Methods: A total of 8 healthy men were enlisted in this study. The serum samples were preprocessed by immersion method. The HPLC system was used to determine the contents of ferulic acid and paeoniflorin in the blood samples of the 8 healthy volunteers， and the blood was collected through the ulnar vein at 5 min， 10 min， 15 min， 30 min， 45 min， 1 h， 2 h and 3 h after MXYD administration. The dates of serum concentrationtime were fitted by using the 3P97 analytical program of pharmacokinetics. The internal standard (IS) was coumarin. The detection wavelengths of paeoniflorin and ferulic acid were 230 nm from 0 min to 10 min and 320 nm from 10 min to 25 min respectively.

Results: After MXYD administration， paeoniflorin and ferulic acid were separated completely in the serum and no other interfering peaks were found in the spectrum of the chromatograms. The retention times of the paeoniflorin and ferulic acid were 8.02 min and 13.32 min respectively， and that of the coumarin was 19.14 min. The mean recovery rates of paeoniflorin and ferulic acid were 100.9% and 95.3% with relative standard deviation (RSD) of 3.2% and 3.4%， respectively. The calibration curve for paeoniflorin was linear over the concentration range 401 280 ng/ml. Its lowdetection limit based on a signaltonoise ratio of 3 was 5 ng/ml and lowconcentration limit was 15 ng/ml with an RSD of 12.5%. Ferulic acid was in the range 10320 ng/ml; its lowdetection limit was 0.65 ng/ml and lowconcentration limit was 5 ng/ml with an RSD of 9.7%. The method was found to be highly precise， with an RSD<5% and interday and intraday variability in the range of 92.1%109.9% for each of the concentrations tested.

Conclusion: This is a study on simultaneously determining paeoniflorin and ferulic acid in serum of healthy volunteers after oral administration of MXYD. The assay is suitable for identifying the serum levels of ferulic acid and paeoniflorin in clinical investigations.

Keywords: Jiawei Xiaoyao Powders; paeoniflorin; ferulic acid; high performance liquid chromatography; pharmacokinetics

自拟加味逍遥散（Modified Xiaoyao Decoction， MXYD）由《太平惠民和剂局方》中的逍遥散加减而成，适用于治疗抑郁［1］和脾气虚型、肝郁脾虚型功能性消化不良［2］。阿魏酸和芍药苷分别来自当归和白芍，是该方的两个主要成分。杨玉兴等［3］应用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography， HPLC）对人服用加味逍遥散后血清中的阿魏酸进行了定性和定量研究；Yang等［4］对狗服用精制后芍药苷的药动学进行了研究；罗焕敏等［5］对大鼠服用当归芍药散后体内芍药苷与阿魏酸同时进行测定，并进行药动学研究。人口服后这两成分的同时检测及药动学研究未见报道。因此，我们利用HPLC对健康人口服加味逍遥散后血清中的芍药苷与阿魏酸进行测定，以便指导加味逍遥散在临床中的应用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 Waters HPLC，包括2996二极管阵列检测器、2695自动进样系统和EmpowerTM 数据处理软件（美国Waters公司）；小神医煎药机（天津三延精密机械有限公司）；3P97药动学分析软件（中国药理学会数学药理专业委员会）。

1.2 药品与试剂 自拟加味逍遥散由当归25 g、白芍药25 g、柴胡25 g、茯苓25 g、白术15 g、生姜10 g、大枣15 g、薄荷15 g、栀子15 g、甘草15 g、牡丹皮15 g、厚朴30 g、枳壳30 g和葛根40 g组成。药材购自四川大学华西医院门诊中药房，均经华西医院中药药理实验室鉴定为正品。加味逍遥散汤剂制备：按照处方比例精确称取各组成药物，总量2.7 kg，放入小神医煎药机中，添加8倍水，浸泡约30 min后煎煮，煮沸后继续煎煮30 min，然后用4层纱布过滤；按上述方法重复煎煮1次。两次煎出滤液合并，32 ℃减压浓缩，使其终浓度为1 g/ml。冷却后置于消毒容器中，密封保存于4 ℃冰箱内备用，用时摇匀，温服。阿魏酸（批号为1107739910）、芍药苷（批号为110736200423）和香豆素（批号为911216）标准品均购自中国药品生物制品检定所。

1.3 健康志愿者入选标准 健康男性8名，来源于招募者。纳入标准：体格检查正常；年龄19～40岁；体质量正常（在标准体质量±10%之内）；获取知情同意，志愿受试。排除标准：有药物及食物过敏史者；1个月内服用过药物者；有晕血、晕针史；精神病患者；嗜烟、嗜酒者；既往有心、肝、肾、胃肠及造血功能障碍等严重疾病者；依从性差者。剔除标准：实验后发现有违背实验方案或使用过影响药物测定的药物和食物，可能干扰实验结果者。终止实验标准：从医学角度考虑受试者有必要中止实验者，如实验过程中发生晕针、晕血，服药后有不适感或过敏反应等。

本研究已获得伦理委员会批准，自愿受试、体检合格者入选。入选者于实验前签署知情同意书。

1.4 实验方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS3（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为甲醇︰0.5%乙酸水溶液（40︰60，v/v），选用香豆精为内标(internal standard， IS)；芍药苷的检测波长在0～10 min为230 nm；阿魏酸的检测波长在10～25 min为320 nm。

1.4.2 标准品溶液配制 阿魏酸1 mg置于容量瓶内，加入50 ml甲醇摇匀；芍药苷1 mg，甲醇定容至50 ml；取香豆素2 mg，甲醇定容至100 ml。3种溶液最终浓度均为20 mg/L。

1.4.3 给药与采血 志愿者于实验前3 d不得饮用啤酒、茶、咖啡及其他饮料；实验前8 h不准进水和食物。实验当天测定其空腹体质量及心率、脉搏、血压；每位志愿者在服用浓缩中药汤剂前抽取静脉血，作为空白对照。取血后按5 g/kg口服一次中药浓缩汤剂。服药后计时，于服药后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h和3 h于肘静脉抽血5 ml；随时记录受试者出现的各种反应，遇特殊情况积极处理；口服中药前与服药后各时间点血标本于3 000 r/min离心10 min，获得空白与含药血清，分装于1.5 ml EP管中，－20 ℃保存。

1.4.4 血清样品的预处理 所有血清（包括空白血清、含药血清及空白加入标准品的血清）均采用水浴法预处理。取1 ml血清放入10 ml试管中，在100 ℃沸水中10 min，搅拌60 s直至均匀，于8 500 r/min离心15 min，取100 μl上清进样。

1.4.5 制作标准曲线及测定最低检测限 取6份1 ml空白血清，分别放入10 ml试管中，加入不同体积的芍药苷和阿魏酸标准品溶液，使芍药苷和阿魏酸在血清中的浓度分别为40、80、160、320、640、1 280 ng/ml和10、20、40、80、160、320 ng/ml。每管分别加入香豆素标准品溶液25 μl，充分混匀后采用上述水浴法预处理，HPLC测定。分别以芍药苷、阿魏酸和内标香豆素的峰面积比与其浓度作线性回归，得到回归方程；当信噪比（signaltonoise， S/N）为3时确定芍药苷与阿魏酸的最低检测限。

1.4.6 精密度与回收率的测定 取3份1 ml空白血清，分别放入10 ml试管中，加入不同体积的芍药苷和阿魏酸标准品溶液，使两者在血清中的浓度分别为40、160、640 ng/ml和10、40、160 ng/ml 3个梯度。每管分别加入香豆素标准品溶液25 μl，充分混匀后按上述血清预处理方法处理后进样100 μl检测。重复上述实验过程，5次/d，使用相同的样品与方法连续测定5 d。以加入血清中芍药苷和阿魏酸的量为标准值，实际测得的峰面积比值代入回归方程计算出计算值，计算值与标准值相比求得回收率和日内精密度，并计算出相对标准偏差（relative standard deviation， RSD）。计算公式分别为：回收率=(计算值/标准值)×100%；精密度=(计算值的平均值/加入标准浓度)×100%；RSD=(标准差/平均值)×100%。

1.4.7 样本血药浓度的测定 对8名志愿者服药后各个时间点的含药血清进行预处理，以本实验色谱条件进样，得到芍药苷、阿魏酸峰面积与香豆素峰面积的比值，将比值代入回归方程，分别得到芍药苷和阿魏酸的血药浓度，并绘制血清药物浓度与时间曲线。

1.4.8 药代动力学参数的测定 采用中国药理学会数学药理专业委员会编制的3P97药动学分析软件对测得血药浓度数值进行拟合得到一系列药动学参数：最大出峰时间（time of maximum concentration， Tmax），最大血药浓度（maximum concentration， Cmax）、分布相半衰期（t1/2α）、表观清除率（apparent clearance， CL/F）和血药浓度时间曲线下面积（area under concentrationtime curve， AUC）等。

2 结 果

2.1 芍药苷、阿魏酸与内标香豆素的分离情况 芍药苷、阿魏酸峰与内标峰，血清内源性物质及加味逍遥散吸收入血的其他成分峰均能很好地实现基线分离，无杂峰干扰；芍药苷、阿魏酸和香豆素标准品在相同条件下进行对照，保留时间分别为8.02、13.32和19.14 min；对其紫外吸收峰予以定性分析，样品的最大紫外扫描波长与标准品一致。见图1和图2。

2.2 标准曲线及最低检测限 空白血清加入芍药苷标准品后，在40～1 280 ng/ml浓度范围内的线性回归方程为y=59.5x+5.48（x代表峰面积比值，y代表血药浓度）(r2=0.999 1)。S/N为3时最低检测限为5 ng/ml，最低检测浓度为15 ng/ml（RSD=12.5%）。空白血清加入阿魏酸标准品后，在10～320 ng/ml浓度范围内的回归方程为y=161.3x－7.82（r2 =0.992 3），最低检测限为0.65 ng/ml，最低检测浓度为5 ng/ml（RSD=9.7%）。

2.3 回收率与精密度 健康人空白血清加入芍药苷和阿魏酸标准品后的平均回收率分别为100.9%和95.3%，平均RSD分别为3.4%和3.2%。见表1。该方法检测芍药苷和阿魏酸日间、日内精密度在92.1%～109.9%，且RSD<5%，均符合分析检测要求，显示了很好的可重复性。见表2和表3。图1 不同血清样品中阿魏酸、芍药苷和内标香豆素的高效液相色谱图 表1 芍药苷和阿魏酸的回收率表2 芍药苷和阿魏酸日间精密度表3 芍药苷和阿魏酸日内精密度

2.4 血药浓度测定 将健康人服药后各个时间点血清中测得的芍药苷和阿魏酸峰面积与内标峰面积相比，所得比值分别代入两者的回归方程，计算出血清中芍药苷和阿魏酸的浓度并绘制血清药物浓度时间曲线。见图3。

2.5 药动学参数的测定 本实验成功地在服药后健康人的血清中检测到了芍药苷和阿魏酸，并建立了同时检测芍药苷与阿魏酸的高效液相色谱法，使用药动学软件得到药动学参数（表4）。药动学参数显示人口服MXTD后芍药苷和阿魏酸被吸收入体内，两者的最大浓度时间大约在服药后45 min左右，然后逐渐下降。表4 芍药苷与阿魏酸在血清中的药动学参数

3 讨 论

汤药进入体内后，血清成分多样，欲确定方剂体内血清成分谱，必须建立汤药进入体内多成分测定方法。本实验完成了健康人口服大复方MXYD浓缩剂后芍药苷与阿魏酸在血中的测定研究，利用HPLC法对芍药苷与阿魏酸同时测定，为其他药效成分的测定方法和药动学研究打下了一定基础，对临床治疗功能性消化不良的中药复方的质量、用量等监测有一定意义。

MXYD治疗功能性消化不良疗效确切。由于是大复方，其中所含化学成分可达几百种，但进入人体的成分才可能是药效成分，所以研究服药后进入人体的成分才能更好地了解加味逍遥散的药理作用。对于MXYD的药动学研究已有开展，但报道多数是单味中药［3］或者动物实验［6］。中药药动学研究最终要回归于对人体的实验。故本实验以“复方效应成分动力学”假说和“生物方剂分析中医药学”思路为理论指导基础，应用HPLC法分析了人口服加味逍遥散后吸收入体内成分芍药苷与阿魏酸的药动学。

本实验建立的检测方法显示了较好的线性关系，具有较好的精密度和准确度。有报道使用内标法根据回归方程计算得到两者的血药浓度，通过对大鼠血清中阿魏酸与芍药苷的药动学研究，结果显示两者最大血药浓度出现时间在2 h和3 h，半衰期1～2 h［5］，明显大于本实验结果。这说明不同实验对象对药物的吸收与体内反应是不同的。本实验方法适用于人口服加味逍遥散浓缩煎剂后芍药苷与阿魏酸血药浓度的测定，为进一步研究加味逍遥散中代表疗效的靶成分以及临床用药量化依据打下了基础。

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