苦参素肝靶向缓释纳米球的制备及大鼠体内分布研究

【摘要】 目的 制备苦参素(KU)纳米球，研究其在大鼠体内的分布。方法采用乳化溶剂挥发法制备苦参素-PLGA-纳米球(KU-PLGA-NS)，建立高效液相色谱分析法，流动相选择0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-甲醇-三乙胺(20∶80∶0.009)，将36只大鼠随机分为两大组，每大组再分3小组，每小组6只，两大组分别经腹腔给药苦参素原料药和制备得到的苦参素纳米球。通过检测大鼠心、肝、脾等组织中的药物浓度，评价其肝主动靶向作用。结果制得苦参素-PLGA-NS平均粒径 190.5 nm，平均包封率为 79.7% ，平均载药量为20.5% 。与苦参素原料药对照，苦参素纳米球在肝组织中的药物峰浓度明显增加，20 min后达9.65 μg/ml。结论KU-PLGA-NS具有缓释和肝主动靶向作用。

【关键词】 苦参素;乳酸-羟基乙酸共聚物;纳米球

苦参素(kurarinone ，KU)又名氧化苦参碱，是从豆科植物苦豆草的种子苦豆子或豆科植物苦参的根中提取的一种生物碱，具有抗炎，抗病毒，免疫机制和抗肿瘤等作用，近年来发现它对病毒性肝炎亦有明显治疗作用[1，2]。纳米给药系统在实现靶向和缓释给药，以及提高难溶性药物的生物利用度，降低药物毒副作用等方面具有良好的应用前景[3，4]。高分子材料乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycollic acid)，PLGA]，因其优良的生物相容性和生物降解性，被广泛用作纳米球(nanosphere，NS)的载体材料，以其为载体的NS克服了纳米乳剂，纳米脂质体药物易泄露等缺点，成为国内外的研究热点之一，为一类新型的靶向给药载体[5，6]。本实验以PLGA为载体，Pluronic F68为乳化剂，采用乳化溶剂挥发法[7]成功地制备了粒径大小适中的KU-PLGA-NS，通过其在大鼠体内的分布研究，探索其用于治疗肝炎的可行性。

1材料与仪器

1.1仪器79-1型磁力搅拌器(金坛市杰瑞尔电器有限公司)，AG285型电子天平(瑞典METTLER TOLEDO 公司)，岛津高效液相色谱仪(包括LC-20AB泵，SPD-M20A紫外检测器及岛津Lcsolution色谱工作站)，C18色谱拄(依利特)，超速冷冻离心机，纳米粒径分析仪(英国Malrern仪器公司)，JEOL型高分辨透射电镜(日本电子珠氏会社)。

1.2药品与试剂苦参素(陕西龙孚生物化工有限责任公司)PLGA(LA/GA=75/25，MW=8 600，济南岱罡生物科技有限公司)Pluronic F-68(西安罗森伯科技有限公司)，甲醇(色谱纯)，丙酮，磷酸二氢钾等其他试剂均为分析纯。标准溶液的配制：水相：0.5%pluronic F-68 称取Pluronic F-68 0.5 g 溶于100 ml的纯化水中。油相：精密称取苦参素19.7 mg;PLGA(75/25)83.5 mg溶于5 ml丙酮中，备用。

2方法

2.1KU-PLGA-NS胶体溶液的制备取3 ml已配好的油相，将其用注射器针头缓慢注入到以一定速度(以不起泡为宜)搅拌的100 ml Pluronic F-68 水相中，常温下磁力搅拌除尽丙酮，搅拌时间以3 h为宜。经0.25 μm微孔滤膜过滤即得苦参素-PLGA-NS胶体溶液。低温避光保存。

2.2形态及粒径观察取KU-PLGA-NS胶体溶液适量，少量纯化水稀释后用1.5%(W/V)磷钨酸负染色，滴于镀膜的电镜铜网上，晾干后，置于透射电镜下观 察纳米球的外观形态并拍摄照片。

2.3色谱分析条件色谱柱为hypersil ODS C18色谱柱(大连依利特公司150 mm×4.6 mm，5μm);流动相为0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-甲醇-三乙胺(20∶80∶0.009);流速为1.0 ml·min-1;检测波长为229 nm;柱温为30℃;进样量为20 μl。

2.4包封率、载药量及利用率的测定精密吸取KU-PLGA-NS胶体溶液500 μl超速冷冻离心(45 000 r·min-1)2 h，精密吸取上清液20 μl，HPLC法测定苦参素含量。计算未包封苦参素的量(M1)，再精密吸取KU-PLGA-NS胶体溶液500μl，用一定体积的混合有机溶剂溶解苦参素和PLGA，测得苦参素的总量，计算胶体溶液中苦参素的含量(M2)，M(PLGA)为PLGA的投药量，按下式计算包封率，载药量和药物利用率。包封率(%)=(M2-M1)/M2 ×100%载药量(%)=(M2-M1)/M(PLGA) ×100%药物利用率(%)=M2/投药量 ×100%

2.5组织内苦参素浓度的测定

2.5.1样品处理将SD大鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、皮肤、肌肉、脂肪、胸腺、骨髓、睾丸/子宫和脑等组织脏器分别称取0.2 g，不足0.2 g的组织按实际重量称取，吸干组织残留血液，按1∶3比例定量加入生理盐水研磨成匀浆，吸取200 μl，置于玻璃离心管中。骨髓取之于大鼠的股骨，剪刀剪断股骨，用注射器吸1ml盐水从股骨断处将骨髓冲出，进行匀浆加入200 μl 的1 mol/L NaOH碱化，涡旋混合30 s，加入乙酸乙酯2 ml，涡漩震荡约45 s，2 000 r/min离心10 min，取有机层，重复1次，合并有机相，40℃氮气吹干。流动相重溶，转移至EP管中，4 000 r/min离心10 min，20 μl进样。考察方法的专属性、线性范围、精密度和回收率等。

2.5.2KU-PLGA-NS大鼠体内分布研究根据新药指导原则规定，将36只大鼠随机分为两大组，每大组再分3小组，每小组6只，两大组分别经腹腔给药苦参素原料药和苦参素靶向缓释纳米球，剂量均为6 mg/kg。于2，20 min和120 min上述时间点股动脉放血处死大鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、皮肤、胸腺、脑、子宫、睾丸、骨髓、脂肪，取样时要注意样本的一致性和代表性，用生理盐水冲去其表面污血，再用滤纸吸干表面的浮血，各组织除骨髓外均称取实际重量，按1∶3(W/V)的比例加生理盐水适量，将组织匀浆，骨髓取之于小鼠的股骨，用注射器吸1 ml生理盐水从股骨处将骨髓冲出，进行匀浆。吸取匀浆液200 μl置于玻璃离心管中，2 000 r/min离心10 min，取有机层，重复一次，合并有机相，40℃氮气吹干。流动相重溶，转移至EP管中，4 000 r/min离心10 min，就可取上清液进样了。

3结果

3.1经透射电镜观察分析纳米球呈类球形，分布较均匀，电镜下计数500个纳米球，得平均粒径为190.5 nm，KU-PLGA-NS的透射电镜照片如图1。

3.2包封率及载药量的测定结果制得KU-PLGA-NS平均包封率平均包封率为 79.7% ，平均载药量为20.5% 。

3.3HPLC检测苦参素的方法学考察

3.3.1方法专属性在以上的实验条件下，生物样品的内源性物质的色谱峰均对苦参素色谱峰无干扰，可以满足生物样品的快速准确分析。结果见图2。

3.3.2线性范围在0.025~1μg/ml范围内，苦参素血浆浓度与色谱峰面积比线性关系良好，线性回归方程为：Y^=0.003 673X+0.044 481(r=0.999 7， P<0.05)(n=7)，最低检测浓度0.01 μg/ml。图1KU-PLGA-NS的透射电镜照片a-空白血浆b-空白血浆+苦参素图2空白血浆和空白血浆加药色谱图

3.3.3回收率和精密度回收率为92.1%~102.1%(n=5)。日内和日间精密度均<6.5%(n=5)。

3.4肝组织中KU浓度测定结果图3显示两种制剂经腹腔注射给药后，2 min时在肝中浓度几乎没有差别。20 min时KU-PLGA-NS制剂在肝中浓度明显高于KU原料药在肝中的浓度，是其1.55倍，说明KU-PLGA-NS制剂具有靶向性;120 min时，KU原料药在肝中的浓度显著下降，而KU-PLGA-NS制剂在肝中的浓度的下降幅度不时很大，说明KU-PLGA-NS制剂具有缓释性。相同时间点KU组比较，*P<0.05，**P<0.01图3分别腹腔注射苦参素和苦参素纳米球后不同时间大鼠肝中药物浓度的比较

3.5苦参素原料和纳米球在体内分布情况如图4和图5所示，苦参素给药后主要分布在肝脏，与KU相比，KU-PLGA-NS在体内的分布发生了很大的变化，苦参素纳米球在肝脏中浓度明显增高，20 min后达9.65 μg/ml。

4讨论

纳米粒的制备方法有乳化溶剂挥发法、液中干燥法、天然高分子凝聚法、自动乳化法、盐析法等。本实验采用乳化溶剂挥发法制备KU-PLGA-NS，此法主要利用机械搅拌法制备载药纳米粒，工艺简便且避免了一些如含氯等有机溶剂的使用，同时制得的KU-PLGA-NS的外观圆整，粒径可控制在50～200 nm范围内，且分散均匀，其包封率和载药量也较高。本实验所采用的高分子材料乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycollic acid)，PLGA]，是由乳酸和乙醇酸以不同比例镶嵌共聚而成的高分子纳米材料，其兼有两种聚酯材料的优势，如质量稳定，生物惰性，生物可降解性且降解速度可调节等优点，由于其优良的生物相容性和生物降解性，被广泛用作纳米球(nanosphere，NS)的载体材料，可延长药物作用时间，从而达到靶向目的，提高药物疗效。图4经腹腔给药苦参素原料药(6 mg/kg)后药物在各组织中分布图5大鼠经腹腔给药苦参素纳米球(6 mg/kg)后药物在各组织中分布将制成的KU-PLGA-NS制剂通过腹腔注射给药后，测得大鼠各组织药物浓度，发现药物在肝中的浓度明显高于以苦参素原料给药后在肝中的浓度，同时在其它组织中的浓度相对较低，使苦参素在肝位的浓度大大提高，提高肝位病灶的治疗效果以及降低对于肝外组织与器官的毒副作用有着重要意义。此外KU-PLGA-NS还显示出一定的体内缓释作用。这种体内缓释作用更有利于药物持续发挥作用，对药物入肝、减轻毒副作用具有重要意义。