复乳法制备雪莲纳米粒的研究

作者：赵心怡，沈琦，李明丽，贾晓光，波拉提·马卡比力

【摘要】 目的利用雪莲注射液中间体为原料，制备雪莲纳米粒，以提高患者对雪莲用药的顺应性和达到缓释作用。方法以复乳法制备雪莲纳米粒，雪莲原料药溶解于乙二醇中作为内水相，聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)溶解在二氯甲烷-丙酮(2∶1)的混和溶剂中作为油相，加入乳化剂形成W/O型初乳后以蒸馏水作为外水相在乳化剂作用下形成W/O/W型复乳纳米溶液。结果纳米粒的平均粒径在134 nm;Zeta电位为-8.06;包封率为42.83%，载药量为2.17%;12 h体外释放39.57%。结论复乳法能够得到性质稳定和具有缓释功能的雪莲纳米粒。

【关键词】 雪莲; PLGA 纳米粒; 复乳法; 缓释

Abstract：ObjectiveTo prepare saussurea nanoparticles by using of saussurea injection intermediate so to improve the patients’ compliance and release slowly. MethodsMultiple emulsion method was used to prepare the saussurea nanoparticles. Saussurea injection intermediate dissolved in ethylene glycol as internal water phase， PLGA dissolved into the mixed solution that dichloromethane ∶acetone was 2∶1 as oil phase， adding emulsifier to form W / O type primal emulsion， then add the primal emulsion to the distilled water contain emulsifier to form W/O/W type multiple emulsion. ResultsThe particles mean size of the best prescription of the nanoparticles was 134 nm， the drug loading was 42.83%， and encapsulation ratio was 16.08%. Vitro release rate was 39.57% in 12 hours. ConclusionThe stable and slow-released saussurea nanoparticles can be prepared by multiple emulsion method.

Key words：Saussurea; PLGA nanoparticles; Multiple emulsion method; Slow-release

雪莲注射液的主要成分包括黄酮、多糖和生物碱类。其中黄酮类成分是雪莲抗炎止痛的主要成分，能够促进肾上腺皮质激素的合成，不但能显著提高小鼠免疫功能，对抗风湿性关节炎[1]，还具有抗癌、解痉、降压和平喘作用[2，3]。生物碱能够收缩血管，改变血管通透性从而起到强心、抗炎抗风湿和镇痛作用。多糖类成分则具有消除自由基、抗疲劳作用，并且能够兴奋子宫平滑肌，治疗妇女小腹冷痛[1]。纳米中药作为中药现代化的重要手段之一，为药物在机体内的吸收和发挥作用提供了更为广泛的选择，赋予传统中药以新的功能，如缓释、增强靶向性、丰富给药途径、提高生物利用度、降低毒副作用等[4]。本文利用包含雪莲有效成分的雪莲注射液中间体为原料药，将传统的注射液改为复乳型纳米溶液，为制成顺应性更高的剂型提供技术支持。

1 材料与仪器

1.1 试剂雪莲原料药(雪莲注射液的中间体，新疆民族药中药研究所提供);聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA，50/50，M=15000，山东岱罡生物公司);芦丁标准品(中国药品生物制品鉴定所);甲醇(上海凌峰化学试剂有限公司)为色谱纯;氢氧化钠、磷酸二氢钾吐温-80、司班-80(上海医药集团上海化学试剂公司)、二氯甲烷、丙酮、乙二醇、甲醇、乙腈等(国药集团化学试剂有限公司)均为分析纯。

1.2 仪器BS124S 电子天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司; SPD-20A 岛津高效液相色谱仪：日本岛津公司;布鲁克海文激光粒径仪Zeta PLUS-90：美国布鲁克海文仪器公司;GG-17旋转蒸发仪：上海大研仪器有限公司;TGL-16C高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂;电镜：JEM-2010/INCA OXFORD， 日本。

2 方法[5，6]

2.1 纳米粒的制备称取10 mg雪莲注射液中间体超声溶解于1 ml乙二醇中，为内水相，称取33.9 mg PLGA加入烧杯中，加入2∶1的二氯甲烷-丙酮至重量为2.56 g，作为油相，加入司班-80 0.25 g，吐温-80 0. 50 g，在油相中加入搅拌子，在磁力搅拌器上高速搅拌使油相和乳化剂混合均匀，然后用注射器抽取0.3 ml内水相缓缓滴加到油相中，3 000 r/min搅拌形成具有蓝色乳光的W/O型初乳。称取吐温-80 0.65 g，加入80 ml蒸馏水中作为外水相，在乳化剂作用下将制得的W/O型初乳滴入其中，900 r/min搅拌制得W/O/W复乳型纳米溶液。最后将制得的纳米溶液在旋转蒸发仪上旋蒸，去除有机溶剂。

2.2 粒径测量取适量雪莲纳米粒胶体分散体系加去离子水稀释10倍，用激光散射粒度测定仪测定其粒径平均大小。

2.3 Zeta电位将稀释10倍的纳米溶液静置1 h，用Zeta电位仪测定其电位，平行测定6次。

2.4 透射电镜实验(TEM)在经透射电镜扫描以前，对纳米溶液应进行处理：配制2%的磷钨酸溶液，将纳米溶液滴加在铜网上后，待表面烘干，滴加1～2滴2%的磷钨酸溶液进行染色，再在灯下将所制样品彻底烘干后进样观察。

2.5 载药量、包封率的测定采用HPLC法对纳米粒的载药量和包封率进行测定。根据雪莲的有效成分采用芦丁(Rutin)作为标准品，以黄酮类成分的含量反映药物的含量。使用迪马C18反相色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)在356 nm波长下以甲醇：0.1%磷酸水溶液5∶5为流动相[7];流速1ml/min。检测得芦丁的保留时间是4.86 min。取所制得的纳米溶液1 ml，用0.1μm微孔滤膜滤去纳米粒，滤液测定得游离药物的量WF，1 ml纳米溶液超声破坏30 min，加4倍甲醇沉淀PLGA，10 000 r/min离心30 min， 进样测定所得浓度×5为药物总量WT。每毫升纳米溶液冻干后质量为WN，每毫升纳米溶液中药物的投入量为WD。按下式计算包封率、载药量。包封率(%)=(WT-WF)/ WT载药量(%)= (WT-WF) /WN

2.6 体外释放实验[8，9]本实验根据2005版《中国药典》配制磷酸盐缓冲液PBS (pH=7.4)作为释放介质，考察雪莲纳米粒的体外释药曲线。剪取10cm长的透析袋，用沸水煮5～10 min，再用蒸馏水冲洗干净。取纳米溶液6 ml， 加12 ml释放介质，转入透析袋中，检查确保不漏液。将透析袋置于盛有70 ml释放介质(PBS)烧杯中，加搅拌子 37℃恒温50 r/min恒速磁力搅拌。在0，2 ，4 ，6 ，8 ，10 ，12 ，24 h后从透析袋外取溶液1.5 ml，同时补充相同体积的释放介质。将取出的样品进行HPLC检测，计算其中药物含量。配制相同药物浓度的雪莲原料药的PBS溶液，按同样方法测量释放速率。

3 结果

3.1 纳米粒的制备和形态考察本实验采用复乳法制备雪莲纳米粒，主要以粒径及包封率为表征参数，考察乳化剂和油相的用量对纳米粒形成的影响。

3.1.1 纳米粒的处方优化处方优化以能形成稳定、大小适度的纳米粒和较高的药物包封率为前提，主要从乳化剂的种类和用量、水油相之比等纳米粒形成的关键步骤来筛选优化处方。见表1～3。表1 内水相乳化剂的用量对纳米粒成型的影响表2 二氯甲烷-丙酮的体积比对钠米粒成型及包封率的影响·表3 油相(二氯甲烷-丙酮)的量对纳米粒成型的影响。

3.1.2 粒径测定粒径，测定结果见图1。纳米粒平均粒径为134.6 nm。图1 处方优化后制备成纳米粒的粒径分布

3.1.3 Zeta电位用Zeta电位仪测定其电位，测得平均Zeta电位为-8.06。说明纳米溶液较稳定。

3.1.4 透射电镜实验(TEM)用透射电镜观察到纳米粒的形态。见图2。图2 优化后处方制备纳米粒的电镜图由电镜照片看出纳米粒形态为类球形，表面较光滑，大小均匀，纳米粒之间基本无黏连。

3.2 载药量、包封率和药物利用率包封率(%)=WT-WF/WT=42.83%载药量(%)=(WT-WF)/WN= 2.17%

3.3 体外释放实验原料药和纳米粒的体外释放实验结果如图3所示：图3 雪莲原料药和雪莲纳米粒体外释放曲线由HPLC测定，计算纳米粒溶液和雪莲原料药的体外累积释放率得知，雪莲原料药体外释放在2 h 达到82.14%，释放速度很快。而在相同条件下，纳米粒溶液在2 h时释放为2.08%，12 h后达39.57%，释放速度减缓，说明所制得纳米粒能达到较好的缓释效果。

4 讨论

根据PLGA和雪莲原料药的理化特性，选用复乳法制备聚合物纳米粒是行之有效的方法。本实验通过改变油相成分及用量、乳化剂用量从而制备得到理化性质较好的纳米粒溶液。

通过体外实验的考察，雪莲纳米粒与雪莲原料药相比能达到缓释作用，但体内是否能提高生物利用度，还有待于进一步考察。