纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白

【摘要】 建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体并进行表面修饰，在其表面固定特异性蓖麻毒单抗并作为探针，用于蓖麻毒蛋白的检测。采用场流分离技术对纳米颗粒探针进行准确表征，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。结果表明：通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与蓖麻毒蛋白等核糖体失活蛋白的特异性结合，应用于目标蛋白的检测。

【关键词】 纳米颗粒探针; 蓖麻毒素; 核糖体失活蛋白; 场流分离; 扫描电镜; 聚苯乙烯

1 引 言

核糖体失活蛋白(Ribosomeinactivating proteins， RIP)存在于许多植物中，植物核糖体失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病虫害或者恶劣的环境[1]。根据蛋白质的一级结构，RIP 可以分成两类：Ⅰ型，由一条多肽链组成;Ⅱ型，是双链蛋白。Ⅱ型双链RIP 由2条或者4条多肽链组成，分子量约为60 或120 kDa，其中一条是A (Active)链，具有N糖苷酶活性;另一条是B (Binding)链，这两条链通过二硫键和非共价键连接[2，3]。蓖麻毒是一种典型的核糖体失活蛋白，由于蓖麻毒来源广泛，禁止化学和生物武器公约把蓖麻毒列为最为严格的控制对 [4，5]。因此，开展对蓖麻毒等核糖体失活蛋白的检测研究具有重要意义[6～8]。目前，检测核糖体失活蛋白的方法有免疫分析法和生物质谱法[9～11]。纳米材料因具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高、表面原子所占比例大等特点而被广泛应用于蛋白检测中[12，13]。场流分离(Field flow fractionation， FFF)是Giddings提出的一种新的分离分析理论[14，15]，它将流体与外加场联合作用于样品，实现样品组分的分离。场流分离技术可分离提纯、收集流体中范围为0.02～1 μm的悬浮物颗粒， 也可作为一种表征技术对样品中纳米颗粒的质量、密度、电荷及其它物理参数的准确测定。场流分离技术根据外加场的不同，可分为沉降场、流体场、热力场、电场和磁场等多种分支，其中沉降场流分离(Sedimentation field flow fractionation)技术较为完善且应用较多[16，17]。

本研究建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体，经表面修饰后在其表面固定特异性单抗，利用沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征，测量出单个聚苯乙烯纳米颗粒结合的目标分子数目，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与核糖体失活蛋白的特异性结合，可应用于目标蛋白的检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

沉降场流分离仪(Postnova， UT， USA);Anton Paar DMA (60/602)振动管密度计(奥地利Anto Paar公司); 场发射扫描电镜 (LEO 1550 EDS/OPAL/EBSD/STEM， Zeiss， Thornwood， USA); Sputter Coater SC7640 离子溅射仪(Quorum Technologies， UK); NAP5及NAP10凝胶渗透柱(通用公司); 5417C离心机(德国Eppendrof公司)。

蓖麻毒素A链(Ricin A Chain， 纯度 98.99%)及其单抗IgG均由美国农业部西部研究中心友情提供;聚苯乙烯纳米颗粒 (240 nm，10%，w/V， Bangs Laboratories Inc. PA， USA);NH4HCO3 (>99.5%)、表面活性剂FL70(Fisher公司);实验用水为MilliQ超纯水 (> 18 MΩ)。纳米颗粒探针制备用试剂套装(含聚氧乙烯聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物(F108PDS)、3(2吡啶二巯基)丙酸N羟基琥珀酰亚胺酯 (SPDP)、二硫苏糖醇(DTT)和磷酸盐缓冲液，pH 7.4)购自Sigma公司。

2.2 实验方法

2.2.1 离心沉降分离检测技术 场流分离技术可视为一种单相的色谱技术，其系统设计为在超薄的样品分离通道的垂直方向上引入一个可调控的外加场(如重力场、离心场等)[11～13]。含有纳米颗粒悬浮液样品在流动相的作用下流过分离通道。当样品进入通道后，样品将暂停一段时间(即Relaxation time，停留注射或松弛步骤)。此时样品中的不同组分由于物理性质的差异， 在外加场的作用下，靠近通道壁的流体比中心处流得慢，不同质量的纳米颗粒在通道中的流速差别会导致其相应的保留时间较大的差异，在流体及外加场的联合作用下，样品组分就得到了分离，沉降场流分离仪结构[18]及分离原理如图1所示。

分 析 化 学第38卷第5期全 灿等：纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白 图1 (a)沉降场流分离仪结构图[18]和(b)沉降场流通道分离原理示意图

Fig.1 (a) Structure diagram of the fieldflow fractionation(FFF) system[18]and (b) working principle scheme of FFF channel纳米颗粒在尺度为940 mm×20 mm×0.254 mm的线型光滑通道中进行，该通道的空隙保留体积为4.49 mL，死体积为0.439 mL，外加场为离心力场。检测时将线型光滑通道置于离心场中随离心机轴向旋转，距离离心机轴的径向距离为15.5 cm。流动相为流速为1.5 mL/min的0.1% FL70溶液。样品进样体积为10 μL，松弛时间为12 min以确保样品在分离通道中平衡，离心机转速500～2000 r/min，紫外检测器波长为254 nm。聚苯乙烯纳米颗粒的密度为1.053 g/cm3[19]。利用振动管密度计测定0.1% FL70的流动相密度为997.1 kg/m3 [20]。

2.2.2 纳米颗粒表面修饰 利用修饰剂F108PDS对聚苯乙烯表面进行修饰，并利用离心沉降分离仪进行表征：按比例取适量修饰剂F108PDS (10 g/L)加入到聚苯乙烯纳米颗粒悬浮液中，在一定条件下使聚苯乙烯颗粒表面物理吸附足够量的修饰剂F108PDS，经分离机离心分离未结合或结合不紧密的修饰剂F108PDS，弃去上清液后用磷酸盐缓冲液重新稀释纳米颗粒，重复上述步骤3次并合并悬浮液涡旋混合，取10 μL纳米颗粒悬浮液样品进行离心沉降分析。

2.2.3 蓖麻毒单抗表面修饰 利用修饰剂SPDP对蓖麻毒单抗进行修饰，并利用离心沉降分离仪进行表征：按比例取适量修饰剂SPDP 加入到蓖麻毒单抗溶液(2.0 g/L)中，在一定条件下反应后，利用NAP5柱分离除去过量的修饰剂SPDP及一些小分子反应产物，再加入适量修饰剂DTT，再利用NAP10柱分离除去过量的修饰剂DTT。

2.2.4 纳米颗粒固定单抗 将端基化的抗体与经表面修饰后的聚苯乙烯纳米颗粒温和反应，离心除去未结合及结合松散的抗体上清液，用缓冲盐再次悬浮并涡旋混合，再离心沉淀的纳米颗粒，即得到具有特异性抗体修饰的纳米探针颗粒，取10 μL纳米探针颗粒悬浮液进行FFF分析，测定其表面抗体结合的程度。

2.2.5 蓖麻毒蛋白的检测 取5 μL蓖麻毒蛋白，加入到2.2.4节制备得到的纳米颗粒探针中，恒温反应。取10 μL纳米探针颗粒悬浮液进行FFF分析，测定其表面抗体与蓖麻毒蛋白的结合程度。

2.2.6 扫描电镜法 将固含率为1%的聚苯乙烯纳米颗粒悬浮， 液滴在带有碳膜的电镜用铜网上，待悬浮液中的载液用氮气吹干后，利用离子溅射仪进行离子溅射镀膜，最后将样品放入电镜样品台上进行扫描电镜观测。 图2 纳米颗粒探针制备机理

3 结果与讨论

3.1 实验机理

以聚苯乙烯纳米颗粒为载体，经表面修饰后在其表面固定特异性单抗，利用离心沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征，测量出单个聚苯乙烯纳米颗粒结合的目标分子的数目，实验机理如图2所示。由于聚苯乙烯纳米颗粒比表面积大，在溶液中分散性好，本实验中纳米颗粒的抗原包被、免疫反应均在准均相溶液中进行，反应更充分，反应物用量更少，反应更完全，可用于痕量、超痕量目标分子的快速检测。

3.2 沉降场流分离法

在2.2.1节的实验条件下，聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流分离谱图如图3所示，保留时间约为46 min。 图3 聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流分离谱图

Fig.3 Fractogram from typical FFF analysis of bare polystyrene(PS) particles

利用沉降场流分离技术测定纳米粒径的原理的报道较多，根据在外加力场作用下，不同质量的纳米颗粒在分离通道中具有不同的保留时间进行分离。在一定实验条件下，通过测定的纳米颗粒的保留时间Tr， 计算纳米颗粒的水力学粒径d， 如式(1)：R=V0/Vr=6λ[coth0.5λ-2λ](1)

Vr=TrF(2)其中，V0为分离通道空隙体积(Void volume)，Vr为一定粒径的保留体积，F为流动相流速，根据实验测得的保留体积值，由式(1)计算出λ，同时λ=KT/[ma(1-ρc/ρα)Gw]=6kT/d3(ρa-ρc)πGw(3) 其中，d为聚苯乙烯纳米颗粒的粒径，k为玻尔兹曼常数(k=1.3806503×10-23)，T为实验温度(K)， ρc为流动相密度(997.1 kg/m3)， ρa聚苯乙烯纳米颗粒的密度(1.053 g/cm3)，w为分离通道的厚度(0.0254 cm)， G为外加离心力场，由式(3)得出: G=2πv602×dc(4)其中v为离心机的转速， dc为分离通道距离离心机轴的径向距离，本仪器中为dc=15.5 cm。

由式(3)和式(4)可计算出粒径d，经多次重复测量，聚苯乙烯纳米颗粒的粒径为246 nm。

3.3 反应条件的影响

实验研究了反应条件的影响，考察反应时间以及搅拌对纳米颗粒表面修饰效果的影响。利用沉降场流分离仪进行测定，保留时间越长，表明聚苯乙烯纳米颗粒的表面修饰效果越好。沉降场流分离谱图如图4所示。由图4可知， 在24 h的反应时间中，通过搅拌可以增强表面修饰效果，保留时间从46.9 min 增加到50.1 min。在表面修饰反应过程中，不论是否搅拌，延长反应时间均有利于改善表面修饰效果，保留时间有显著增大趋势;反应6 d后进一步延长时间则无显著性效果。通过优化实验，本实验反应时间选择24 h，并伴随搅拌。

图4 聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流分离谱图

Fig.4 Fractogram from FFF analysis of 240 nm polystyrene particles

A. 聚苯乙烯祼珠(Bare PS particles， RT=45.288 min); B. 1天没有搅拌(1 Day without stiming， RT=46.860 min); C. 3天没有搅拌(3 Days without stiming， RT=48.368 min); D. 7天没有搅拌(7 Days without stiming， RT=53.556 min); E. 1天有搅拌(1 Day with stiming， RT=50.060 min); F. 6天有搅拌(6 Days with stiming， RT=54.220 min)。3.4 纳米颗粒探针的准确表征

图5 聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流分离谱图

Fig.5 Fractogram from FFF analysis of 240 nm polystyrene particles

A. Bare PS particles; B. F108; C. F108IgG; D. F108IgGRicin.制备得到的纳米颗粒探针基体为聚苯乙烯纳米颗粒、依次包被了F108PDS、蓖麻毒抗体以及蓖麻毒蛋白。图5为聚苯乙烯纳米颗粒及其经过多层包被的沉降场流分离谱图，各层的密度均大于沉降场流分离过程中流动相的密度，各层吸附在聚苯乙烯纳米颗粒上使其总质量增大，表现为沉降场流分离过程中保留时间的延长。

吸附各层的质量可通过各自的保留时间计算，结果见表1。单个纳米颗粒的粒径为246 nm; 根据其密度可以计算出单个聚苯乙烯纳米颗粒的质量为9.4×10-18 g/PS; 根据吸附各层的质量可计算出每个聚苯乙烯纳米颗粒上结合约16510个F108PDS分子，923个IgG抗体分子和1665个Ricin 蛋白分子。表1 纳米颗粒探针多层表面组成沉降场流分离计算结果

3.5 扫描电镜法测定结果

图6A和6B分别为聚苯乙烯纳米颗粒及其结合了蛋白的扫描电子显微镜图。图6A可见清晰的球形聚苯乙烯纳米颗粒，而图6B则非常模糊，包被有其它物质，且纳米颗粒也略呈椭球型不规划颗粒，表明聚苯乙烯颗粒在探针制备前后其形貌有显著性变化。但鉴于仪器的分辨率限制，本实验中未能观测到聚苯乙烯颗粒在探针制备前后纳米颗粒粒径的显著性变化。

研究结果表明，研制的纳米颗粒探针能够与蓖麻毒蛋白等核糖体失活蛋白的特异性结合，可应用于目标蛋白检测，对于痕量、超痕量的核糖体失活蛋白的检测具有重要意义。