生物传感型核壳纳米颗粒的制备与应用

作者：罗洁 曾光明 汤琳 尹娟 黎媛萍

【摘要】 近年来纳米材料在各领域已受到人们越来越广泛的关注，尤其是核壳型纳米颗粒的制备技术在不断更新发展，在生物传感器方面有着巨大的应用前景。本文重点介绍了生物传感型核壳颗粒的工作原理、制备方法及其在电化学生物传感器、光学生物传感器以及压电晶体生物传感器上的最新应用进展。

【关键词】 核壳， 纳米颗粒， 制备， 生物传感器， 评述

1 引言 纳米技术是20世纪80年代末崛起的新技术，在材料、光学、化工、医药、环境保护等诸多领域得到广泛的应用[1]。纳米颗粒是指尺寸在1～100 nm之间的粒子，它是由数目极少的原子或分子组成的原子群或分子群，介于宏观物质和微观原子与分子中间的领域，是一种典型的介观系统。其特殊的结构导致它具有许多独特的性质，如表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应等。传感器追求微型化、灵敏度高、响应速度快[2]，纳米颗粒的特点满足了这些要求，而核壳结构的纳米颗粒可以进一步提高纳米材料的性能，广阔的复合空间与纳米粒子独特性能的结合，使粒子复合技术成为材料领域的又一亮点。核壳部分可由多种材料组成，包括高分子、无机物和金属等。包覆在外面的壳层材料可改变颗粒的光、电、磁等物理性质，在生物传感器领域有着广泛的应用前景。

２ 生物传感型核壳结构纳米颗粒工作原理 核壳结构的纳米颗粒具有比表面积大、良好的生物相容性以及电催化性等优良的性质，在应用于生物传感器时体现了其优越的适用性。核壳纳米颗粒在生物传感器应用主要有几种形式：构建活性界面用于固定生物材料；作为标记物应用于传感器等。

2.1 构建活性界面固定生物材料 核壳颗粒具有保持生物组分活性的性质，而且能加快生物分子与电极表面之间的电子转移，可提供固定生物材料的活性界面（如图1）。图1中将抗体固定在核壳颗粒上，再与特异性抗原结合。DNA以及酶等生物分子在检测等过程中极易失活，而固定在核壳颗粒上，核壳颗粒结合了不同材料的优点，不仅具有良好的生物相容性，保持其生物活性，且比用其中一种材料修饰的检测信号更强。Feng等[3]将CeO2/壳聚糖组合矩阵首次应用于单链DNA探针的固定，组成的生物传感器具有无毒性以及高的电子传导率，加强了单链DNA探针在电极表面的负载，用于结肠直肠癌基因的检测。Marcos等[4]在核壳颗粒上固定肽核酸（PNA），特异性地与互补DNA杂交。Tang等[5]用磁性核壳纳米颗粒(Fe3O4/SiO2)构建界面固定漆酶，构造电化学生物传感器来检测堆肥中苯磷二酚，核壳颗粒良好地保持了漆酶的活性。Yang等[6]用逐层自组装的方法制备了碳纳米管/壳聚糖复合材料，并将胆固醇氧化酶固定在电极上，设计了一种用来检测胆固醇浓度的生物传感器。纳米复合颗粒大幅度提高了固定化酶的催化活性，增加电极的电流响应灵敏度，改进生物传感器的抗干扰性能。

图1 核壳颗粒作为活性界面（略）

Fig.1 Nanoparticle acts as active interface 在将核壳纳米颗粒用于生物传感器构建过程中，关键是如何将生物材料(酶、抗原、抗体、生物组织、细胞、DNA等)稳定地、高活性地固定到传感换能器(基体电极、晶振片、光极等)表面，提高和改善生物传感器的测定重复性、灵敏度、线性范围、检出限及使用寿命等特性。常用于将生物材料固定在传感换能器表面的主要方法有吸附固定法、包埋法、交联法、共价键合法及定向固定法等。

2.2 作为标记物应用于生物传感器 对核壳纳米粒子作为标记物的检测方法主要有分光光度法、荧光分析法和电化学分析法。分光光度法是根据纳米粒子标记DNA探针在分子杂交反应前后最大吸收波长的变化进行测定。由于纳米粒子的激发光谱宽，且连续分布，而发射光谱呈对称分布且宽度窄，颜色可调，即不同大小的纳米粒子能被单一波长的光激发而发出不同颜色的光，并且光稳定性高，不易降解，所以可用荧光分析法对纳米粒子标记物进行测定。电化学分析法是一种新的检测纳米粒子标记物的方法。由于所用纳米粒子多为金属微粒或半导体纳米材料，根据组成纳米粒子的金属不同，其相应的氧化还原电位也不相同，可以通过对纳米粒子标记物中的金属含量的测定，达到对纳米粒子标记物的测定的目的。常用的电化学手段有循环伏安法、溶出伏安法、差分脉冲伏安法等。 Cai等[7]在壳聚糖修饰的电极上修饰ssDNA，与金纳米粒子标记的寡核苷酸探针杂交，加入银纳米的修饰剂，在金表面在线沉积纳米银，得到银包裹的金纳米粒子，利用高灵敏度的微分脉冲伏安法检测银，从而使检测ssDNA的灵敏度提高了2个数量级，检出限可达50 pmol/L。Palecek等[8]在DNA 序列的检测中引入磁性微粒，用磁性微粒标记寡核苷酸作为探针，与待测的DNA分子杂交后，磁场分离杂交分子，利用阴极溶出法进行DNA 的检测，降低了检出限。段菁华等[9]采用油包水的反相微乳液方法，首次以羊抗人免疫球蛋白(IgG) 标记的异硫氰酸荧光素(FITC)为核材料，成功地制备了FITC的核壳荧光纳米颗粒， 克服了采用传统方法制备核壳荧光纳米颗粒中存在的荧光染料泄露的问题。该核壳荧光纳米颗粒比细胞小很多，且具有生物亲和性，可为纳米生物传感器件提供新型材料。基于该核壳荧光纳米颗粒的标记方法也为生物医学提供了一种新型的非同位素分析方法。 Cai等[10] 用低温法制备了一种以Cu为核，Au薄层为壳的核壳型纳米粒子，使之易于与ssDNA进行功能性聚合。这种核壳型Cu/Au纳米粒子与有5′巯基修饰的ssDNA 偶联，制备成纳米标记的DNA 探针，待测ssDNA固定在玻碳电极表面。当它与相对应的纳米Cu/Au核壳型纳米粒子标记DNA 探针杂交后形成含有纳米标记物的DNA 杂交分子。与金纳米探针相比，Cu/Au对DNA的杂交过程所产生的电信号具有明显的放大作用。Huang等[11]使用CdSe/ZnS核壳量子点作为荧光标记检测α人类IgE生物素，达到良好的效果，之后又将量子点作为指示剂对尿素进行定量分析[12]。核壳纳米颗粒的特殊性质使传感器具有好的适应性及高灵敏度。Xu等[13]将抗 单克隆抗体包被功能化的荧光核壳纳米颗粒，作为标记物用于夹心荧光免疫检测中。校准曲线在1.0～75.0 μg/L范围内呈良好的线性关系，检出限达到0.3 μg/L。 核壳纳米颗粒利用其不同于传统材料的优良性质，在作为标记物中体现了其特殊的光学性质、催化性质等，极大提高了生物传感器的各项性能，提高响应灵敏度，提高抗干扰能力。

3 生物传感型核壳颗粒的制备

3.1 溶胶凝胶法 溶胶凝胶法是合成纳米复合颗粒的一种重要方法。在含有聚合物共溶剂体系中，使得烷氧金属或金属盐等前驱物水解和缩合。如果条件控制得当，在凝胶形成与干燥过程中聚合物不发生相分离，即可获得。这种方法具有成本低、工艺简单、组分易于控制等优点。 溶胶凝胶法在半导体/SiO2纳米复合材料的制备与结构控制方面具有重要作用，该方法设备简单、反应温度低，可制备其它方法难以制备的化合物。Jayasankar等[14]用一种简单的溶胶凝胶方法合成氧化铝钛酸铝核壳结构。这种方法在控制复合颗粒的粒径大小、低温合成及烧结等方面效果显著。在氧化铝基中低温合成钛酸铝归因于试剂间大的接触面积。该方法晶粒生长不明显，且具有很好的增浓作用。

3.2 沉积法 沉积法是指将金属快速散射于预定的表面上，而聚合物可以直接加热蒸积到衬底上，也可以是一般单体或聚合物材料经高温热解产生出可聚合性单体散射于衬底聚合而得，可以与金属散射同时聚合，也可以先行聚合再处理。 Sathish等[15]通过沉积法合成AuTiO2复合颗粒。如果用CdS 修饰TiO2纳米管阵列，反应生成的CdS晶粒在衬底上的沉积过程实质是一个表面吸附成核的过程。在光滑的薄膜表面上吸附能力较弱，成核密度较低；反之，表面适当粗糙的衬底，却有较强的活性和吸附能力，成核密度高[16]。Flores等[17]制备了SiO2@Ag核壳纳米颗粒，用直径为(4±2) nm的Ag纳米颗粒包覆直径为(50±10) nm的Si纳米微球。在水/乙醇混合液中，原硅酸四乙酯作为硅源，将AgNO3作为Ag的来源而并未加入交联剂，在制备过程中，将溶液中的Ag+转化为Ag纳米颗粒沉积在Si微球表面，形成了均一的核壳结构纳米微球。Shishkanova等[18]将聚苯胺沉积在聚乙烯表面，用来控制聚合膜的厚度。在聚N乙烯吡咯烷酮存在的条件下，苯胺的氧化是在分散态下进行的。

3.3 原位聚合法 原位聚合法也称就地聚合。即在柔性聚合物或其单体中溶有刚性聚合物单体后，再就地聚合，生成的刚性聚合物分子均匀地分散在柔性聚合物基体中，从而形成分子复合材料。原位聚合在很大程度上提高了纳米粒子在聚合物基体中的分散性，提高了聚合物复合材料的力学性能。 在合成核壳颗粒过程中，壳层的交联剂含量对粒子的尺寸的影响很大。任现文等[19]用原位聚合法成功地制备出不同响应温度的温敏性聚乳酸/聚异丙基丙烯酰胺co丙烯酰胺核壳胶束。实验中当交联剂的摩尔分数从5%提高到15%时，粒子在25 ℃下的流体力学直径从170.2 nm增加到886.5 nm。Liu等[20]用原位聚合法合成了SiO2/聚吡咯核壳颗粒，聚吡咯微球的壳厚度是可以控制的。Jing等[21]采用原位化学氧化聚合法合成了Ag/聚苯胺的核壳结构。Liu等[22]用原位氧化聚合法合成了 @聚苯胺（ATP@PANI）核壳颗粒，并研究了HCl浓度的影响以及ATP@PANI复合颗粒的导电性能。核壳颗粒的壳厚度很容易通过过程参数来控制，如单体浓度和热水温度等。Luo等[23]等将聚苯胺原位聚合到Si纳米颗粒上，形成核壳结构，更容易吸附辣根过氧化物酶，同时也增大了活性电极表面积。

3.4 自组装技术 自组装是指组装单元通过非共价键作用自发形成热力学稳定且具有明确有序结构的聚集体的过程，自组装技术制备的核壳式微球，其壳层形成的驱动力是中心粒子和壳层间所带的相异电荷，或是相邻壳层间相异电荷的静电引力，实现物理吸附。也可以引发层间的化学反应产生交联，提高了壳层的稳定性。 宋秀芹等[24]采用逐层自组装方法在二氧化硅球表面交替组装了十二烷基硫酸钠单分子膜和TiO2纳米粒子膜，该复合多层膜经高温煅烧得到了核壳型纳米结构TiO2/SiO2复合颗粒。利用Ｘ射线、扫描电镜、X射线能谱等对复合颗粒进行了表征。结果表明：TiO2在复合颗粒表面排列紧密、均匀，粒径约50 nm，复合颗粒中TiO2的含量随组装层数的增加而均匀增加。Au/C[25]， CdS/聚电解质[26]等核壳颗粒都可通过自组装方式合成。Bizdoaca等[27]用自组装的方法合成核壳颗粒，由640 nm直径聚苯乙烯微球核以及5层12 nm直径Fe3O4纳米晶体组成。Yang等[28]通过层层自组装技术合成生物功能化的荧光微球，用于免疫检测分析。首先将多层荧光标记的聚电解质覆盖在胶体颗粒上，再包覆上蛋白质层，实验结果显示其具有很好的效果。Chen等[29]制备了以聚苯乙烯为核，将4乙烯基吡啶/Au自组装在核表面形成核壳结构，表面组合颗粒具有更高的催化活性和接触反应效率。Wang等[30]采用层层自组装技术形成AuC@SiO2复合物并构造H2O2生物传感器。

４ 核壳颗粒在生物传感器的应用

4.1 核壳颗粒在电化学传感器中的应用 电化学生物传感器是以酶、微生物、抗原或抗体、细胞、动植物组织为敏感膜，以将生物量转换为电信号的电化学电极为转换器的装置。图2为原理流程图，首先通过吸附沉积等作用形成核壳颗粒，在电极表面修饰化学基团，利用化学基团与核壳颗粒的作用将核壳颗粒固定，再在颗粒表面连接生物分子，用于电化学检测。 Cai等[7]研究的金银复合纳米粒子在DNA 检测中使灵敏度较一般的单个纳米粒子标记的DNA 探针提高了2个数量级。Liu等[31]将络氨酸酶修饰的磁性核壳颗粒MgFe2O4SiO2利用磁力固定在碳糊电极上，构造苯酚生物传感器，采用循环伏安法等电化学手段对苯酚进行检测。Wang等[32]将Si@Au核壳颗粒（GNSs）通过自组装技术，固定在丙基三甲氧基硅烷（APTES）修饰的氧化铟锡（ITO）电极表面，形成GNSs/APTES/ITO电极。核壳颗粒能提供大的表面积以及具有良好的导电性，促进血色素与电极间的直接电子转移。此外，还据此构筑了高效的H2O2生物传感器。Zhang等[33]利用Fe3O4/SiO2核壳磁性纳米颗粒修饰碳糊电极并用于检测对苯二酚。Qiu等[34]利用二茂铁修饰的磁性核壳Fe3O4/SiO2纳米颗粒合成新型的葡萄糖生物传感器，获得的磁性生物纳米颗粒连接到碳糊电极表面，并作为酶与电极之间电子转移的媒介。此生物传感器可以在1.0×10－5～4.0×10－3mol/L线性范围内检测葡萄糖。Yan等[35]合成银聚苯胺核壳复合物，构造生物传感器，在中性环境中有很好的电化学行为，并对抗坏血酸维生素C的氧化有抑制作用，能在抗坏血酸维生素C浓度为多巴胺5000倍的情况下检测多巴胺。

图2 核壳颗粒应用于电化学生物传感器的原理流程图（略）

Fig.2 Principle flow chart of core/shell nanoparticles applied in electrochemical biosensor

4.2 核壳颗粒在光生物传感器中的应用 光生物传感器选择性地识别分子信息，引发光学变化，且把光学变化转换为电信号输出。可利用的光学信号很多，包括光吸收、荧光、表面等离子体共振等。光生物传感器具有灵敏度高、不需要参比、光传播信号不受外界电磁干扰等特点。图3为核壳颗粒应用于光生物传感器的原理图，首先在平板表面组装上底层，再将作为核的纳米颗粒连接在底层上，并在颗粒外覆盖壳层，利用其特殊光学性质进行检测。

图3 核壳颗粒应用于光生物传感器的原理流程图

Fig.3 Principle flow chart of core/shell nanoparticles applied in optical biosensor Endo等[36]发展了基于表面等离子体共振生物传感器的新型非标记细胞检测方法。他们使用核壳纳米颗粒作为层基片，通过固定在传感器表面的抗体和抗原的特异性反应而产生的折射率变化，检测细胞代谢物。在此表面等离子体生物传感器中，通过光学性质的检测来判断抗体与细胞代谢物之间的特异性反应，固定在传感器上的抗体的检出限为10 ng/L。 Huang等[37]由传统的金纳米棒与Na2S2O3或 Na2S反应生成一类虫状的新型金纳米棒。这种金金硫化物核壳结构的金纳米棒的灵敏度比传统的纳米棒高，这种特性使金纳米棒在生物传感器构造以及生物分子识别研究中有广泛的应用前景。核壳颗粒的特殊光学性质，可将其用于光吸收。Enders等[38]通过表面增强红外吸收（SEIRA）来检测抗体抗原的特异性反应。SEIRA膜是将金纳米颗粒沉积到SiO2/Si晶片表面得来的。在将特异性抗体固定到金纳米颗粒上后，样品暴露在特异性抗原中，然后采用红外光谱检测样品。

4.3 核壳颗粒在压电晶体生物传感器中的应用 压电生物传感器是一种将高灵敏的压电传感器技术与特异的生物反应结合，通过换能器将生物信号转化为易于定性或定量检测的物理或化学信号的新型生物检测分析方法。压电晶体具有高度灵敏性的质量响应特征，其频率变化与结合在其上的物质质量相关。显然，具有生物亲和性质的组分检测，可以构建压电传感器。 高效地将免疫活性材料固定到传感表面是设计生物传感器的关键步骤。Ding等[39]通过将金纳米颗粒自组装到纳米级的羟基磷灰石上，来设计压电免疫传感器的界面，通过检测α胎蛋白抗原抗体系统来研究此传感器的性能，并将此种免疫传感器的免疫反应与抗体单独固定在羟基磷灰石或纳米金上的进行比较。实验发现，用此种传感器的传感界面，抗原抗体活性更高。可以在15.3～600.0 μg/L范围内对胎蛋白进行检测。Jia等[40]将细胞连接到壳聚糖/多壁碳纳米管修饰的金电极上，使用压电石英晶体微量天平来控制，这种组合物的化学性质以及形态学都用扫描电极以及红外光谱表征。实验显示这种纳米组合物与细胞有更好的生物相容性。５ 展 望 核壳结构的纳米复合粒子由于其特殊的结构具有许多优异的性质，不同于单一的材料，往往具备核层和壳层材料的性能，有着新的光学、电化学以及光电转换等特性，一直是研究的热点。以前的研究主要集中在核壳聚合物粒子领域，现在的研究深入到内核或外壳为聚合物、氧化物、贵金属等，而且核壳结构的纳米颗粒的组成、形貌和表面性质是可调的，有着重要而广阔的应用前景。生物传感器在免疫学、医学、食品等领域都有着普遍应用，而且已被成功应用于环境中痕量有害物质的分析与检测[41]。生物传感型的核壳粒子作为一种新型的复合材料，它必将受到人们越来越多的重视。如量子点纳米颗粒由于其量子尺寸效应，大小不同或组成材料不同即可发不同颜色的荧光，而且可用单一波长的光激发多种颜色不同的量子点，更适合现今生物大分子的分析检测，近年来被广泛用于生物学标记。生物可降解纳米颗粒的研究也受到越来越多的重视，它们包裹活性物质，使其与周围介质相隔离以避免过快降解，并能在需要时释放活性物质。将核壳纳米颗粒应用于生物传感器的检测，提高了传感器的性能，使其可检测的目标物浓度越来越低，使生物传感器的研究更加深入。但是，部分核壳材料的形成机理及核与壳材料的协同作用机理尚不明确，而且许多制备工艺也完善，制得的纳米复合材料的性能往往无法与期望的完全符合。因此，为了使核壳型纳米复合材料得到更广泛的推广应用， 还需要大量深入的研究。