磁纳米探针检测人绒毛膜促性腺激素

作者：刘儒平 刘军涛 王蜜霞 罗金平 刘春秀 蔡新霞

【摘要】 采用链霉亲和素包被磁纳米粒子，将生物素标记的特异性抗体偶联在磁纳米粒子上，制备出高特异性的磁纳米探针；利用此探针对人绒毛膜促性腺激素（HCG）进行测定，建立了定量检测蛋白类激素的化学发光分析方法。利用紫外可见分光光度计、透射电镜及动态光散射仪对磁纳米探针进行表征，同时对化学发光实验条件进行优化。在2×10－4 mol/L鲁米诺、8×10－4 mol/L H2O2， pH=13的优化条件下，将磁纳米探针用于HCG的定量检测。结果表明，所测发光强度与待测HCG浓度之间线性相关，相关系数r为0.9924，线性检测范围由常规板式ELISA的5～200 μg/L扩展到0.5～250 μg/L; 相对标准偏差为3.82%。采用本方法和常规ELISA法同时对34份人血清标本HCG进行测试，两者相关性良好。利用制备的磁纳米探针定量测定微量蛋白类激素，具有灵敏、高效、快捷、检测范围宽等优点，有望应用于其它微量蛋白的检测。

【关键词】 化学发光免疫分析法， 磁纳米探针， 动态光散射， 人绒毛膜促性腺激素

1 引言 磁纳米探针技术是以免疫学为基础，利用包被有免疫活性物质的各种磁纳米粒子进行免疫学或生物学分析的一项技术[1，2]。在磁纳米粒子的表面引接具有生物活性的专一性抗体，可制备得到免疫磁纳米探针[3]。该探针因具有比表面积大、可快速移动及单分散性良好等优良性能，可在磁场下定位、富集和分离[4]。化学发光免疫分析法在对免疫物质的定性、定量和生物细胞活性功能检测方面应用较为广泛，常用于超痕量活性物质的测定。该方法具有灵敏度高、检测范围宽，可实现全自动化等的优点。用化学发光免疫标记物代替放射性同位素，避免了使用放射性同位素的危害，操作方法简便快速[5]。 人绒毛膜促性腺激素（Human chorionicgonadotropin，HCG）是一种蛋白类激素，绒毛膜癌、葡萄胎等疾病的治疗均需对HCG进行定量测定[6]。目前，用于定量检测HCG的方法有放射免疫法和酶联免疫法。放射免疫法具有敏感度高、特异性好等优点，但却存在放射性污染的缺点；酶联免疫法不存在放射性污染问题，但灵敏度相对较低， 定量测定范围较窄[7]。本研究采用磁纳米探针检测微量蛋白类激素，综合了化学发光法灵敏度高、线性范围广、测定速度快，以及酶联免疫法的特异性高、准确性好的优点，同时利用磁性微粒在磁场中可控运动的特点，将待测物快速富集，具有更快的检测速度[8]。此种磁纳米探针初步应用于临床标本的检测，取得了良好的效果。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂 F4500荧光光谱仪（日本日立公司）； 123.20D DynaMagSpin磁分离器（挪威Dynal公司）； SI0146 VortexGenie旋涡混合器（美国科技仪器有限公司）； 20/20n化学发光多功能光度计（美国Promega公司）； UV2250 PC紫外可见分光光度计（日本岛津公司)； 802型动态激光光散色仪（美国Viscotek公司）； ZHWY2102C恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）； J2010透射电子显微镜（日本电子公司）; BIOTEK Elx808酶标仪（美国BIOTEK公司）。 人绒毛膜促性腺激素(青岛康原药业有限公司)；生物素标记的鼠抗αHCG抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；辣根过氧化酶（HRP）标记的βHCG抗体（天健生物制药有限公司）；鲁米诺试剂与H2O2（北京禾尚友生物技术有限公司）；四甲基联苯胺(TMB，万泰生物药业）；磁性颗粒（陕西北美基因股份有限公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水。

2.2 实验方法

2.2.1 磁纳米生物探针的制备 取25 μL生物素标记的鼠抗αHCG抗体（3 g/L），加入350 μL PBS缓冲液（pH 7.4），配制成抗体溶液。采用缩合反应将链霉亲和素偶联在磁纳米粒子上[9～11]，将100 μL链霉亲和素修饰的磁纳米粒子工作液（5 g/L）与该鼠抗αHCG抗体溶液混匀，置于37 ℃，150 r/min 的恒温摇床中反应30 min，利用生物素和链霉亲和素之间的高亲和力将生物素标记的特异性抗体偶联在磁性纳米粒子上，制备成具有高特异性的磁纳米探针。探针洗涤后加入500 μL封闭液（0.05% Proclin 300与10%酪蛋白的TrisHCl缓冲液），在37 ℃，180 r/min恒温摇床中振荡30 min后磁性分离。用PBS缓冲液清洗后，加入PBS缓冲液配制成浓度为1 g/L的磁纳米探针溶液，置于4 ℃避光保存，备用。

2.2.2 磁纳米探针的表征 采用紫外可见分光光度计测定标记前的鼠抗αHCG抗体溶液(Pre)、标记后的上清液(Post)及标记过程中清洗液（Wash）在280 nm处的吸光度，根据公式（1）计算抗体与磁纳米粒子的偶联效率（Coupling efficiency， E）。E＝ＯＤpre－ＯＤpost－∑ＯＤwashＯＤpre×１００％（１）移取适量链霉亲和素修饰的磁纳米粒子与磁纳米探针于两个试剂杯中， 分别加入PBS缓冲液稀释，超声处理5 min，制备成分散悬浮液，使聚集颗粒分散为原始粒子， 并使原始粒子在分散液中保持良好的分散状态。采用动态光散射仪对磁纳米粒子及磁纳米探针的有效粒径及粒径分布进行测量。同时采用透射电子显微镜（TEM）观测磁纳米探针的形貌。

2.2.3 磁纳米探针用于HCG浓度的测定 采用双抗体夹心法，利用制备的磁纳米探针对HCG样品进行定量检测。将HCG磁纳米探针、待测HCG样品溶液、HRP标记的鼠抗人βHCG抗体置于离心管中，使三者充分混合，然后置于37 ℃摇床反应25 min，形成磁纳米探针待测HCG抗原酶标抗体的复合物，在磁性分离区域用PBS缓冲液进行洗涤，并采用单因数法对化学发光体系的实验条件进行优化。在优化实验条件下，在上述复合物中加入化学发光底物液（鲁米诺与H2O2），酶催化底物发光，用20/20n单光子计数仪检测光强，通过光强与待测物浓度的对应关系计算样品中HCG的浓度。

3 结果与讨论

3.1 磁纳米探针的表征 采用紫外可见分光光度计在280 nm处测得标记前的鼠抗αHCG抗体溶液吸光度ODpre(280)=1.755、标记后的上清液吸光度ODpost(280)=0.30、 标记过程中清洗液吸光度∑ODwash(280)=0.1752。按照公式（1）计算得抗体偶联效率为72.9%，表明生物素标记的αHCG抗体与链霉亲和素修饰的磁纳米粒子具有良好的偶联特性，抗体能高效地偶联在修饰后的磁纳米粒子表面，形成磁纳米探针。

图1 磁纳米探针的形貌（略）

Fig.1 TEM image of the magnetic nanoparticle probes 采用透射电子显微镜对磁纳米探针的形貌特征进行描述。如图1所示，合成的磁纳米探针具有良好的单分散性。 使用激光动态光散射仪来测定磁纳米探针制作前后的平均粒度及粒度分布范围，结果分别如图2a和图２b所示，实验数据见表1。 图2 亲和素包被磁纳米粒子(a)和磁性纳米探针（b）的粒径分布（略）

Fig.2 Size distribution of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles(a) and magnetic nanoparticle probes(b)

由图2a可知，在探针制作前表面修饰链霉亲和素的磁珠粒径为106６ nm，粒径分散度为7.7%。其中存在粒径为9754 nm的产物，是链霉亲和素修饰的磁纳米颗粒之间的团聚体。这种团聚体会影响良好的磁纳米探针的形成，造成检测误差。为消除这种团聚，通过添加适量的缓冲液（缓冲液中含有阴离子），并采用超声分散，使制作的水相中的磁纳米探针之间存在静电排斥力和空间位阻效应，以达到较佳的分散效果。磁纳米探针的平均粒度及粒度分布范围如图２b所示，磁纳米探针粒径为1295 nm，粒径分散度为8.6%，可见此探针具有较好的粒径分散度；粒径为3.52 nm的粒子为游离出的αHCG抗体单体，粒径为117 nm的粒子为αHCG抗体多聚体或αHCG抗体与链霉亲和素的聚集体。

表1 亲和素包被磁纳米粒子与磁纳米探针的粒径与相对颗粒数分布（略）

Table 1 Distribution of diameters and relative numbers of streptavidinlabeled magnetic nanoparticles and magnetic probes 3.2 化学发光反应的最优实验条件

3.2.1 鲁米诺浓度对发光强度的影响 移取50 μL辣根过氧化酶标记的βHCG抗体（原液浓度为0.66 g/L，用PBS缓冲液按1∶10000稀释），分别考察了4×10－5～6×10－4 mol/L的鲁米诺溶液对体系发光强度的影响，结果如图3a所示。当其它条件不变时，随着鲁米诺浓度增大，体系的化学发光强度也随之增大，当其浓度为2×10－4 mol/L时，相对发光强度达到最大；浓度继续升高时，发光强度开始下降。因此，为保证该体系检测发光强度最高，鲁米诺浓度选为2×10－4 mol/L。

图３ 鲁米诺浓度(a)， H2O2浓度(b)和pH值(c)对相对光强的影响（略）

Fig.３ Effect of luminol concentration(a)， H2O2 concentration(b) and pH(c) on chemiluminescence intensity

a，b. 2×10－4 mol/L H2O2; 0.1 mol/L Tris缓冲液(Buffer solution)， pH=11.83。 c. 2×10－4 mol/L鲁米诺(Luminal)；8×10－4 mol/L H2O2； 1.6×10－5 g/L HRPβHCG抗体（Antibody）.

3.2.2 H2O2浓度对光强的影响 移取50 μL辣根过氧化酶标记的βHCG抗体（原液浓度为0.66 g/L，用PBS缓冲液按1∶10000稀释）， 在鲁米诺浓度为2×10－4 mol/L时，考察了H2O2浓度在4×10－5～1×10－3 mol/L范围内对相对光强的影响，如图3b所示。体系光强随着H2O2浓度的增大而增强; 当H2O2浓度为8×10－4 mol/L时，H2O2鲁米诺体系具有最大的化学发光强度; 随着H2O2浓度的继续增大，体系发光强度降低。因此，H2O2最优浓度为8×10－4 mol/L。

3.2.3 pH值对光强的影响 鲁米诺化学发光反应在碱性条件下进行[12]，辐射出最大发射波长为425 nm 的化学发光。因此，采用0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3缓冲体系为测定工作液，在反应中，通过改变鲁米诺溶液中NaOH的浓度来改变反应体系的pH值，以提高反应体系的灵敏度，进一步考察了上述最优浓度配比的H2O2鲁米诺体系在pH 8.0～14.0范围内变化时，pH值对H2O2鲁米诺体系发光强度的影响。图3c表明，若pH<8.0时没有光信号产生；当pH>8.0时，体系发光强度随pH值的增大而缓慢增强；pH =13时体系的发光强度迅速增到最大；当pH>13时，发光强度迅速减小。因此，最优pH值选择pH=13。

3.3 样品测定

3.3.1 干扰实验 考察与HCG有部分类似结构的不同浓度蛋白类激素对10 μg/L HCG标准品测定的干扰情况。结果表明，40 μg/L的促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素（FSH）、雌二醇(E2)对HCG的测定均无影响（RSD＜5%)，证明本磁纳米探针特异性强。

3.3.2 稳定性和重现性 利用同批次制备的磁纳米探针对6份浓度为10 μg/L HCG标准品进行了重复性实验，相对标准偏差为3.82%；利用不同批次制备的磁纳米探针对6份浓度为10 μg/L HCG标准品进行检测，相对标准偏差为3.94%，具有良好的重现性和再现性。采用4 ℃避光保存的同一批次制备的磁纳米探针，每3 d对同一浓度的HCG标准品进行检测，24 d内测定8次，相对标准偏差为4.02%。结果表明，本探针在24 d内具有良好的稳定性，具体有效期仍需进一步研究。

3.3.3 HCG标准曲线测定 在最优实验条件下，依据检测体系中待测物浓度与化学发光强度在一定条件下呈线性关系的原理[13]，利用制备的磁纳米探针，采用化学发光检测仪对不同浓度HCG标准品进行测定。结果表明，HCG浓度在0.5～250 μg/L范围内与相对发光强度具有良好的线性关系。其线性方程为y=32.953x+5390.3，相关系数r=0.9924。

图４ 磁纳米探针分析法与ELISA法相关性分析散点图（略）

Fig.４ Scatterplot of correlation analysis between magnetic nanoparticle probe and ELISA

本探针的检测待测样品时间少于40 min，具有检测速度快、特异性高、灵敏度高等特点。

3.3.4 实际样品测定 采用同批次制备的磁纳米探针检测了34例临床血清标本（首都医科大学附属北京佑安医院健康体检人群血清标本），同时采用常规ELISA方法进行平行检测。常规ELISA方法检测HCG时，首先绘制不同浓度的HCG与ELISA吸光度之间的标准曲线，然后将所测样品的OD值换算为浓度。两者结果经线性相关分析后得散点图（图４），结果显示，将特异性磁纳米探针用于检测蛋白类激素与常规ELISA法具有良好的相关性，线性相关方程为y=0.9979x+2.4625， 相关系数r=0.9743。 本研究建立了一种宽范围定量检测蛋白类激素的方法。本方法操作简单，快速，灵敏度高，无放射性污染，具有应用于检测蛋白质类和多肽类抗原的应用前景。