发光金纳米粒子测定曲通X100及其临界胶束浓度

作者：刘玫瑰 曹春 曹明 朱昌青

【摘要】 参照文献方法合成了BSA保护的水溶性发光金纳米粒子， 并考察了此探针在非离子表面活性剂曲通X100中的发光行为。根据观察到的发光增强效应， 建立了一种简单的测定曲通X100的方法。考察了发光金纳米粒子的浓度、体系酸度、反应时间及共存物质对测定的影响。在最佳条件下， 发光强度与曲通X100的浓度分别在0～150 μmol/L和150～600 μmol/L范围内分段成正比关系。两条工作曲线的交点所对应的浓度与曲通X100的临界胶束浓度十分吻合， 为胶束形成过程提供了直接的指示。作为一种生物相容性探针， 发光金纳米粒子被用于生物学样品中曲通X100的分析测定， 结果令人满意。

【关键词】 曲通X100， 临界胶束浓度， 发光金纳米粒子

1 引 言

曲通X100(TX100)是一种重要的非离子表面活性剂， 广泛应用于生物化学领域[1，2]。如在免疫组织化学和免疫细胞化学中， TX100可通过溶解细胞膜上的脂质成分， 使抗体进入细胞[3]。检测TX100的浓度， 对理解它与一些物质的相互作用具有重要意义。Singh等[4]使用微分扫描热分析、荧光和圆二色谱法研究了TX100与球蛋白的相互作用， 发现两者之间可通过直接的键合作用结合， 且两者结合的化学计量比随TX100浓度不同而变化。魏晓芳等[5]研究了TX100与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用， 发现二者会形成复合物， 由此导致BSA荧光猝灭。 在不同TX100 浓度下， 二者的结合常数和络合比均不同。TX100在溶剂中缔合形成胶束时所需的最低浓度即临界胶束浓度(CMC)， 是一个重要的物理参量。常用的测量方法有电导法、表面张力法、折射率法及光散射法等[6]。荧光方法具有操作简单， 分析速度快的特点， 也常用于表面活性剂及其CMC值的测定。 迄今所用的探针大多为有机荧光染料[7，8]。

与有机荧光染料相比， 发光金纳米粒子(Luminescent gold nanoparticles， GNPs)具有独特的发光性能和良好的生物相容性等优点。近年来， 利用各种方法[9～11]合成出的GNPs已用于溶液中Hg2+ [11]和Ni2+ [12]的测定， 以及细胞成像[10]分析。

本实验参照文献[13]的方法合成了牛血清白蛋白(BSA)修饰的GNPs。实验发现， 水中的溶解氧对GNPs的发光有明显的猝灭效应，而在体系中加入TX100， 则能有效降低溶氧对GNPs猝灭。在最佳条件下， 发光强度与TX100的浓度分别在0～150 μmol/L和150～600 μmol/L范围内分段成正比关系， 可据此建立灵敏的测定TX100的发光方法。此外， 两条工作曲线的交点所对应的浓度与TX100的CMC值十分吻合， 为测定其CMC值、判断胶束的形成提供了简单的方法。利用此生物相容性探针， 测定了实际生物学样品中TX100的含量， 结果令人满意。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

F4500荧光分光光度计(日本Hitachi公司); U3010紫外可见分光光度计(日本Hitachi公司); JEOL2010高分辨电镜(HRTEM， 日本电子株式会社); 851型磁力搅拌器(江苏金坛正基仪器有限公司); TGL16C型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin， BSA); 曲通X100(Triton X100， TX100， 上海国药集团化学试剂有限公司; 所用试剂均为分析纯; 水为二次蒸馏水。

2.2 实验方法

2.2.1 GNPs的制备[13] 0.125 mL 1% HAuCl4·4H2O(m/V)稀释到20 mL，加入134 mg BSA ， 剧烈搅拌2 h， 加入30.6 mg NaBH4继续反应24 h， 高速离心除去较大粒径的粒子后备用。HAuCl4·4H2O与BSA的摩尔比是3∶1。以L色氨酸的量子效率(QY)为基准(QY=0.14)， GNPs的量子效率QY=0.052 ， 与文献[13]一致。

2.2.2 样品处理 在一系列10 mL具塞试管中分别加入0.48 mL GNPs溶液、1 mL 0.1 mol/L Na2CO3NaHCO3(pH 9.9)缓冲溶液， 然后加入不同量的TX100标准溶液或样品溶液， 稀释至6.0 mL并充分摇匀， 在室温下放置10 min后进行荧光测定。

荧光测量在室温(15 ℃)下进行， 采用光通路10 mm的石英比色皿， 激发波长为320 nm， 激发和发射狭缝宽度为10 nm; 光电倍增管的电压为-700 V。

实际样品由安徽师范大学生命科学学院提供。取校园植物(卷柏、雪松)， 剪碎， 放研钵中加液氮磨碎。称取该新鲜植物细胞样品0.1 g， 用0.001 mol/L TX100溶液在65 ℃水浴中振荡处理50 min， 离心后取不同量的上层清液按分析步骤进行测定。

3 结果与讨论

3.1 发光金纳米粒子的表征及其与TX100的相互作用

图1是GNPs的透射电镜图。 由图1可以看出， 所制备的GNPs的尺寸约为5.3 nm， 尺寸较均一。如图2所示， 随着TX100浓度增加， GNPs的荧光发射逐渐增强， 且发射峰位自412.4 nm， 红移至423.3 nm。此现象的原因可能同于胶束对有机染料的增敏作用。在胶束形成之前， 以单体形式存在的TX100与GNPs作用[4]， 不断改善了GNPs所处的微观环境， 稳定其发光， 使荧光增强。当TX100胶束形成后， 在GNPs表面形成保护层， 有效地减小了分子间碰撞机率和氧的猝灭常数， 屏蔽了GNPs的激发态， 有利于荧光与非辐射去活化过程及各种猝灭过程的竞争[14]， 使体系位能下降和粒子激发态的电子能级下移， 导致荧光峰红移[13～15]。对照实验发现， 水中的溶解氧能猝灭GNPs的荧光。 当通入氮气后，荧光强度明显回升， 可见胶束能有效地避免溶氧对GNPs的发光猝灭。

.3.2 实验条件优化

3.2.1 发光金纳米粒子浓度选择 随着GNPs浓度的增加， 荧光增强程度逐渐增加。 但是当粒子浓度达到8.0 μmol/L(以BSA浓度计算)[13]时， 可能是由于GNPs间的自猝灭效应， 发光增强程度开始降低。为获得高的分析灵敏度， 选择了8.0 μmol/L GNPs用于进一步的实验。

3.2.2 酸度与介质的影响 用10 μmol/L TX100考察了其pH 4.0～10.8的GNPs的发光增强作用(图3)。由图3可见， pH在3～12变化时， GNPs本身的发光强度有很大不同， 这与文献[13]一致， 但荧光增强程度基本保持不变， 说明酸度对测定的灵敏度影响不大。实验选择了pH 9.9的Na2CO3NaHCO3缓冲溶液。 图3 不同pH时GNPs在TX100存在(F)和不存在(F0)条件下的发光强度

3.2.3 反应时间的影响 试剂混合10 min后， 体系的发光强度即趋于稳定， 因此，选择10 min后测定发光强度。

3.3 干扰实验

考察了几类可能共存的物质对10 μmol/L TX100测定的影响。阳离子表面活性剂十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基三甲基溴化铵、氯代十六烷基吡啶;阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠和部分生化物质血红蛋白尿、细胞色素C、小牛胸腺DNA、葡萄糖等在至少高于10倍测定量时对测定无干扰。高于20倍测定量的SO2-4，CO2-3，Ca2+， Mg2+， Bi3+，Mn2+，Zn2+对TX100的测定也不产生明显干扰， 但是Ni2+，Cu2+ ，Hg2+ ，Ag+能猝灭GNPs的发光。它们的存在， 尤其是在浓度较高时， 会对TX100的测定产生干扰。因此， 在某些样品的实际测定中， 采取适当的措施， 如巯基棉处理[16]来消除这些共存重金属离子的干扰。

3.4 工作曲线

如图4所示， 在最佳条件下， GNPs的荧光强度与TX100的浓度在0～150 μmol/L和150～600 μmol/L范围内分段呈线性关系。据此可建立测定TX100的简单方法。本方法具有较宽的浓度范围， 分析的灵敏度略高于文献[17]方法。在最佳条件下， 对20 μmol/L TX100进行6次平行测定， 标准偏差为 2.8%。 图4 在320 nm激发光激发下， GNPs的发射强度与TX100溶液浓度的关系

Fig.4 Relations of Triton X100 concentrations with the emission intensity of GNPs excited at 320 nm

从图4可见， 两条工作曲线(5次测定的标准偏差分别是3.3%和3.1%)的交点对应的TX100的浓度为0.18 mmol/L， 与文献[18]报道值(170～300 μmol/L)十分吻合， 表明GNPs是测定TX100 CMC的一种理想的探针。

3.5 实际样品的测定

利用GNPs这种生物相容性探针， 对经TX100处理后的卷柏和雪松细胞样品中TX100含量进行了测定(表1)， 加标回收率为96%～105%， 表明本方法可用于某些生物学样品中TX100的实际分析。表1 实际样品中TX100的含量测定