二维纳米金单层膜的构建及其生物电化学应用

作者：侯冬梅 池晓雷汪学英 尹凡

【摘要】 利用LangmuirBlodgett (LB)技术在氧化铟锡(ITO)电极上制备了二维纳米金(nanoAu)单层膜，采用扫描电子显微镜表征了二维纳米金单层膜。实验结果表明：表面压为28 mN/m时，可获得分散性好、形状规则且分布均匀的二维球形纳米金单层膜。利用LB技术制备了肌红蛋白(Mb)薄膜，并将其固定在二维纳米金单层膜修饰的电极表面，研究了肌红蛋白LB膜的直接电化学行为。结果表明：纳米金粒子能够有效地加速肌红蛋白的电子转移，其电子转移速率为1.415 s-1。

【关键词】 纳米金单层膜， LangmuirBlodgett技术， 肌红蛋白， 电子转移速率

1 引 言

纳米粒子的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应及宏观量子效应等导致纳米粒子的热、磁、光和敏感特性不同于常规粒子，这使得它具有广阔的应用前景。由于纳米金粒子具有较大的比表面，表面原子的巨大剩余成键能力使得纳米金粒子较容易团聚、沉聚，所以须对其进行修饰与保护[1，2]，以实现对纳米金粒子尺寸、粒径分布和组装维数的控制。其中二维有序纳米金微粒阵列表现出独特的电、磁和光学性质，在光学器件、超高密度信息储存及纳米电子器件等方面均有可观的应用前景[3，4]。目前，二维纳米材料单层膜阵列的组装方法有LB技术[5，6]、自组装[7]和电泳沉积[8]等，其中LB膜以其超薄、均匀有序、厚度可控、结构可任意设计以及在分子水平上能任意组装的特点，成为获得二维纳米金有序单层膜的极好途径。曲鹏等[9]采用LB技术制备了纳米金粒子单分子膜;Chen[10]用双硫醇分子在亚相表面处理纳米金粒子单层膜，得到相互连接的二维纳米金颗粒的网络结构。

电化学生物传感器因其潜在的应用价值而成为目前分析化学领域研究的热点之一。在电极表面固定蛋白质的方法有吸附法、包埋法和共价键合法等。由于纳米金生物兼容性好、易于电子传递等优点而被广泛应用于电化学生物传感器设计，例如利用纳米金吸附固定辣根过氧化酶的H2O2生物传感器[11，12]等。

本研究以化学还原反应制备纳米金溶胶，实验表明：表面修饰二十二酸甲酯的纳米金粒子能在气/液界面形成分散性好、形状规则且分布均匀的二维球形纳米金单层膜，用SEM表征所得的单层膜的表面形貌，并采用LB技术将制备的肌红蛋白(Mb)单层LB膜修饰在二维球形纳米金单层膜修饰的电极表面，研究Mb单层膜在其修饰电极上的直接电化学行为。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

612D型Langmuir槽(英国Nima公司);Parstat2273型电化学工作站(美国PE公司);CHI660c型电化学工作站(上海辰华仪器公司);S517型号扫描电子显微镜(日本日立公司);实验采用三电极体系：饱和甘汞电极为参比电极，铂片(7 mm ×2 mm)电极为辅助电极， ITO(3 cm×0.7 cm)电极为工作电极， ITO电极(长7 mm)之上用石蜡封住一部分，这样就能保证每次使用的电极面积都一致。肌红蛋白(BR，上海国药集团化学试剂有限公司)，高氯金酸(AR，上海国药集团化学试剂有限公司)， 0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(含 0.1 mol/L KCl)，其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。实验前用氮气除氧30 min以上，实验时保持氮气氛围并在室温下进行 。

2.2 ITO基片的亲水处理

依次将ITO基片放入V(乙醇)∶V(丙酮)∶V(氯仿)=3∶2∶1的混合液和二次蒸馏水中，在25 ℃下分别超声清洗3次;然后将其放入质量浓度为20 g/L NaOH 溶液中超声1 h。此时ITO基片表面呈亲水性，清洗备用。

2.3 纳米金氯仿溶液的制备

根据文献[13]制备纳米金溶胶，加入10 mg二十二酸甲酯于40 mL纳米金溶胶中，再加10 mL氯仿，超声萃取。纳米金表面基本被表面活性剂所占据，纳米金粒子表面为疏水性，能在气/液界面形成单层膜，置于冰箱保存。

2.4 二维纳米金单层LB膜的制备

亚相为二次蒸馏水，挂上Wilhelmy吊片，将亲水ITO基片垂直插入水中。用微量注射器将纳米金氯仿溶液均匀铺于水面，待氯仿挥发后(约30 min)，纳米金粒子能在气/液界面形成稳定的Langmuir膜，设定垒压缩速度为15 cm2/min，在垒压缩过程中记录等温πA曲线。当膜压达到设定值时，保持相同膜压1 h，使Langmuir膜均匀稳定。在此膜压下用垂直提拉法以1 mm/min的速度将其转移到ITO基片上，即得二维纳米金单层LB膜。

2.5 Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO电极的制备

将上述制备的ITO修饰电极垂直插入水中，先在气/液界面上铺展30 μL 1 g/L二十二酸甲酯，待其形成稳定的Langmuir膜，再将100 μL 1.5 g/L Mb均匀铺在二十二酸甲酯Langmuir膜表面，待膜压稳定一段时间后，以15 cm2/min速度压膜，采用Z型LB膜法制备Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO电极，膜压为50 mN/m，提拉速度为1 mm/min。 分 析 化 学第37卷第9期侯冬梅等：二维纳米金单层膜的构建及其生物电化学应用

3 结果与讨论

3.1 纳米金单层LB膜πA等温线

由于纳米金的制备是在水相中进行，因此纳米金粒子表面是亲水性的。而用LB技术制备二维纳米金单层膜，首先需对纳米金粒子表面进行疏水处理。用过量的二十二酸甲酯对纳米金粒子表面进行修饰使其为疏水性并于氯仿溶液中萃取，疏水性的纳米金粒子能在气/液界面上形成稳定的Langmuir膜。图1分别为二十二酸甲酯修饰的纳米金单层膜(曲线a)和二十二酸甲酯单层膜(曲线b)的πA曲线， 图1 二十二酸甲酯修饰的纳米金单层膜(a)和二十二酸甲酯单层膜(b)的πA等温曲线， 亚相为二次蒸馏水

Fig.1 πA Isotherm of nanoAu modified with methyl docosanoate monolayer(a)and methyl docosanoate monolayer(b) on pure water surface可以看出两条等温曲线存在显著的差异，说明纳米金粒子的确存在于膜中。纳米金单层膜在压缩过程中出现气态、液态和固态3种状态，气态时的纳米金粒子处于随机分散状态，微粒间没有相互作用，膜压不随膜面积减小而变化;液态时的膜压随膜面积减小而显著上升，膜的可压缩率变小;固态时的膜压急剧增大，所有分子在亚相表面上都基本上成对地排列并密集充填形成稳定的单层膜，曲线几乎呈垂直状态。从图1a可见，薄膜由液相转换到固相时的膜压约为26 mN/m。为获得紧密有序的二维纳米金单层膜，选择膜压为28 mN/m沉积纳米金单层膜。

3.2 纳米金单层LB膜的表面形貌

图2是利用SEM对不同膜压下获得的二维纳米金单层膜进行表征的结果。单层膜是由修饰了二十二酸甲酯的球形纳米金粒子和游离二十二酸甲酯组成，这样被修饰层包裹着的纳米金粒子呈现各向均一的疏水性，并且纳米金粒子表面基本被二十二酸甲酯所占据，而游离的二十二酸甲酯会有一定的相互嵌入，从而得到有序稳定的单层膜。由图2b可见，表面压为28 mN/m时可获得分散性好、形状规则且分布均匀的二维球形纳米金单层膜，纳米金粒子的平均粒径约为15 nm。比较图2a， 2b和2c可见，在不同膜压下得到的纳米金单层膜的表面形貌明显不同。膜压为18 mN/m时，ITO表面的纳米金粒子较稀疏(图2a); 在膜压为28 mN/m时，纳米金粒子间间距减小，粒子排列变得紧密，并且粒子分布均匀; 当膜压为38 mN/m时，纳米金粒子发生了重叠及团聚，薄膜的单层性很差，表面的缺陷显著增加(图2c)。因此，膜压为28 mN/m时可获得分布均匀和单分散性好的二维球形纳米金单层膜。

3.3 纳米金单层LB膜的表征

3.3.1 电化学循环伏安法 在2.0 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(含0.1 mol/L KCl)溶液中采用循环伏安法表征二维纳米金单层膜。根据探针分子的氧化还原行为和修饰电极前后的峰电流变化，绘制裸ITO电极(图3a)、二维纳米金LB膜修饰的ITO电极(图3b)和二十二酸甲酯LB膜修饰的ITO电极(图3c)在探针[Fe(CN)6]3-/4-分子溶液中的循环伏安曲线。由图3可见，裸ITO电极的氧化还原峰电流最大;当ITO电极表面修饰二十二酸甲酯单层LB膜后，氧化还原峰电流明显降低，说明电极表面的二十二酸甲酯单层LB膜较为致密，对探针[Fe(CN)6]3-/4-分子形成了有效地阻碍;当二十二酸甲酯修饰的纳米金LB膜修饰ITO电极时， 其电极的氧化还原峰电流远大于二十二酸甲酯单层LB膜修饰电极的电流响应，表明纳米金粒子有良好的导电性，其存在极大地提高了修饰电极的电子传导能力。

3.3.2 电化学交流阻抗法 化学交流阻抗法(EIS)是用小幅度交流信号扰动电解池，观察体系在稳态时扰动跟随情况，是研究电极过程动力学及电极界面现象的重要手段[14]。图4为3种不同修饰电极的交流阻抗曲线。采用R(C1R1)(QR2)(C3R3)电路模型拟合修饰电极的阻抗曲线，其中并联的C3， R3分别代表电极表面修饰膜的双电层电容和阻抗值。由拟合结果可知：裸电极阻抗值最小，约为48 Ω;表面覆盖一层致密的二十二酸甲酯LB膜后，其阻抗值增加到1413 Ω，说明不导电的二十二酸甲酯LB膜有效阻止了溶液中带电粒子与电极表面的接触;而纳米金膜修饰电极的阻抗值为389 Ω，这可能是由于纳米金颗粒的存在使电极表面二十二酸甲酯LB膜存在缺陷，有利于带电粒子通过。对于裸电极和二十二酸甲酯修饰电极，双电层电容值均为1.0×10-6 F;而纳米金修饰电极的双电层电容值为1.0×10-9 F，与裸电极及二十二酸甲酯修饰电极相比，其双电层电容值减小较多，这可能是由于纳米金的隧道效应使电子易于透过纳米金表面的水分子层或二十二酸甲酯层，从而降低了双电层的充放电性能。

3.4 Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO电极的制备

蛋白质的固定化方法有吸附法、溶胶凝胶法、包埋法、交联法等，这些方法制备的蛋白质薄膜的有序性和单层性均较差，而LB膜法制备的蛋白质单层膜具有高度各向异性的层状结构并且在理论上几乎是没有缺陷薄膜，本研究小组提出了利用LB技术制备蛋白质复合膜的新方法，制备了Hb十八胺混合薄膜，并应用于双氧水生物传感器设计[15]。本研究采用LB技术制备肌红蛋白混合LB膜并固定在电极表面。

将100 μL(1.5 g/L)Mb均匀铺在30 μL (1 g/L)二十二酸甲酯形成的Langmuir膜表面，膜压迅速上升，表明Mb分子已经进入二十二酸甲酯单层膜中。当膜压到达平衡时，以垒速为15 cm2/min的速度压缩混合薄膜，得到了πA等温曲线(图5A，曲线b)，与二十二酸甲酯单层膜的πA等温曲线(图5A，曲线a)相比，在一定膜压下，Mb二十二酸甲酯混合薄膜的膜面积较大，说明Mb分子的确存在于二十二酸甲酯单层膜中。而Mb二十二酸甲酯混合薄膜等温曲线上的平台说明在压缩过程中发生了相变，即由液相转变为固相，此时的膜压约为40 mN/m，而固相时分子排列较紧密，因此选择50 mN/m作为混合薄膜的沉积压。

3.5 Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO电极的直接电化学研究

图5B为不同修饰电极在pH 7.0 PBS(含0.1 mol/L KCl)的循环伏安图，其中nanoAu修饰电极(曲线1)未出现任何氧化还原峰信号，只出现了该体系的背景电流;Mb二十二酸甲酯混合薄膜修饰电极(曲线2)与Mb二十二酸甲酯/nanoAu修饰电极(曲线3)均出现一对明显的氧化还原峰。阴、阳极峰电势Epc和Epa分别为-0.138和-0.069 V，式量电位为E°′为-0.104 V，表明电化学响应源于所固载的Mb血红素辅基中氧化还原中心Fe/Fe的氧化还原。阴、阳极峰电流比约为1，说明Mb的氧化还原是可逆的。而Mb二十二酸甲酯/nanoAu修饰电极的峰电流明显大于Mb二十二酸甲酯修饰电极的峰电流，说明nanoAu确实对Mb的直接电子转移起到了促进作用，同时纳米金粒子的高表面能为Mb分子提供了一个特殊的、具有生物兼容性的微环境，能与底物分子发生特殊的具有选择性的相互作用，提高了电极的电流响应。此外，纳米金粒子又具有良好的导电性和宏观隧道效应。因此，Mb和电极间可近似看作是一种导线联系，从而快速促进Mb的氧化还原电活性中心与电极间电子转移，有效地增大了电子转移速率;因其具有较高的比表面积，纳米金粒子的存在，能给Mb分子提供了更自由的取向，为Mb直接电子传递构筑更合适的方式，使其电活性中心更靠近导电性电极表面，从而更有利于电子传递反应的发生。

图6A为Mb二十二酸甲酯/nanoAu/ITO电极在0.1 mol/L pH 7.0 PBS(含0.1 mol/L KCl)中不同扫描速率下的循环伏安曲线。随着扫描速率从40 mV/s增加到300 mV/s， 氧化还原峰电流与扫速呈线性关系(图6B)，相关系数均>0.999，表明Mb的电化学反应为典型的表面控制的准可逆过程[16]，这进一步证明了Mb很牢固地固定在二维纳米金单层膜修饰电极表面。另外，随着扫描速率的增加，阴、阳极峰峰电位分别向正、负方向产生较小的偏移，ΔEp增加，但E°′几乎不变。根据扫速与峰电位差的关系，利用有关电极表面异相反应动力学常数的计算方法[17]，可以得到Mb直接电化学反应的电子转移速率常数κs为1.415 s-1。这一数值与文献[18]报道的Mb电子转移速率常数κs(0.41 s-1)相比大了3倍多，说明电极表面的微环境更有利于Mb的直接电子转移。

4 结 论

其它方法制备的二维纳米金有序单层膜通常在纳米金粒径控制、薄膜厚度及排布均匀性等方面存在一定的局限性，而LB技术可以采用颗粒大小一致的纳米金在气液界面形成纳米金Langmuir膜，通过精确控制制膜条件来获得二维纳米金有序单层膜。实验结果表明，利用本方法制备的纳米金膜中纳米金粒子分散均匀，且制备操作简单，有望在纳米电子器件的制备中发挥重要的作用。在后续研究中，将此技术应用于生物电化学传感器研究。