核磁共振电信号内标法在人体尿液定量分析中的应用

作者：杨亮， 茹阁英， 唐惠儒 刘朝阳

【摘要】 研究了Varian谱仪核磁共振电信号内标法在人体尿液代谢物浓度测定上的应用，通过实验证明了该方法进行定量分析的可靠性。NMR电信号内标法原理上是通过Varian谱仪去耦通道在常规一维谱图上产生一个参考信号，并利用谱仪软件程序来调整该信号在频谱上的强度、频率、衰减速率等参数。避免了代谢组学中NMR定量实验需要添加已知浓度物质（例如TSP）作为内标而引起的内标物与样品相互作用、谱峰重叠、内标物不溶及弛豫时间太长等问题。研究结果表明，Varian谱仪去耦通道产生的电信号稳定可靠（标准偏差0.36%），能够用于定量分析；当样品浓度大于20 mmol/L或小于2 mmol/L时，该方法测定的相对误差分别为1%和5%。通过配制低浓度的尿液模型样品，验证了电信号内标法测量人体尿液代谢物的浓度的可行性，最后使用该方法测量真实的人体尿液中常见代谢物的浓度，测定结果与医院常用生化分析仪器的测定结果相符。

【关键词】 核磁共振; 电信号内标; 人体尿液; 定量分析

Abstract We report a complete assessment for urinary quantitative analysis by using an electronic signal as an internal reference， which was generated via decoupling channel on a Varian NMR spectrometer with its amplitude， frequency and transverse relaxation time digitally programmable according to a decoupling shape file. The electronic signal with excellent stability (standard deviation 0.4%) avoided possible problems such as insolubility， interaction and spectral overlap for a traditional internal reference. Concentration determination using the electronic signal proved to be reliable by a series of quantitative experiments. The relative error of quantification was about 1% and 5% when the analyte concentration was above 20 mmol/L and below 2 mmol/L respectively. We further measured the concentration of human urinary metabolites in a simultaneous fashion using this electronic internal reference and obtained consistent results with the values measured by the biochemical analysis instrument used in hospitals.

Keywords Nuclear magnetic resonance; Electronic internal reference; Human urine; Quantitative analysis

1 引 言

核磁共振（NMR）定量分析作为一种分析复杂样品中化学成分含量的有效方法在有机化学[1，2]，药物控制[3]，疾病诊断[4，5]和代谢组学[6～8]等研究领域有着广泛的应用。NMR定量分析的显著优点是经过一次实验就可以获得被测样品中所有成分的含量，因此，NMR定量分析方法对于尿液，血清等包含数以百计代谢物的复杂样品的浓度测量尤为重要[9～13]。NMR定量实验通常需要一个参照标准，常见的参照标准是在样品溶液中直接加入已知浓度的内标物，在NMR定量分析时，将样品指定基团上质子的共振峰面积与内标物共振峰面积进行比较，通过内标物作为参照计算样品的浓度。因此，所选的内标物必需溶于分析溶剂，与样品中任何组分不能有相互作用，并且内标物与样品共振峰不能重叠等。显然，这些对内标物的要求限制了NMR作为一个通用定量分析方法进行使用。Akoka等[14～16]提出了NMR电信号内标法，通过测定样品中H/D的比例检测氘代试剂中氘百分含量，并把该方法应用到二维NMR和MRI的定量实验中[17，18]。Ziarelli等[19～21]将电信号内标法应用于固体NMR实验中进行定量分析。这些NMR电信号内标法定量实验基本上都是在Bruker谱仪上进行的。最近，Mehr等[22]在Varian谱仪上使用一个定向耦合器把电信号耦合到NMR谱仪的接收通道实现了电信号内标法。 本研究在Varian谱仪上采用了电信号内标法，即通过去耦通道产生一个电信号，并由探头13C线圈耦合到NMR谱仪的接收通道。通过实验证明了此方法定量分析的可靠性，并选择低浓度样品（如尿液）进行了分析应用，为代谢组学和生化检测等研究领域提供了一种通用可选的NMR定量分析的方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Varian INOVA 500MHz高分辨核磁共振波谱仪（美国Varian公司）。甘氨酸（Glycine）、二水合柠檬酸钠（Trisodium citrate dihydrate）、葡萄糖（Glucose）、NaH2PO4·2H2O和K2HPO4·3H2O等（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；丙氨酸（Alanine）和缬氨酸（Valine， 生化纯，上海贺宝化工有限公司）；D2O（99.9%）和TSP（3Trimethylsilyl[2，2，3，3D4] propionate）（美国Cambridge Isotope Laboratory公司）。

2.2 样品制备

称量10组甘氨酸（2.0～20.0 mg）和TSP（1.8～6.0 mg），分别溶于10根含0.5 mL D2O的5 mm核磁共振样品管中（样品浓度见表1），用于测量NMR电信号内标法定量分析的可靠性和误差范围。

称量葡萄糖3.89 mg，丙氨酸1.85 mg，缬氨酸2.49 mg，二水合柠檬酸钠5.93 mg和TSP 1.69 mg，以D2O配制的磷酸缓冲液（0.08 mol/L K2HPO4， 0.02 mol/L NaH2PO4， pH=7.4）溶解，并定容至10 mL（样品浓度见表2）。该低浓度模型样品，用来验证NMR电信号内标法在定量分析中的可行性。

取糖尿病患者和正常人尿液各450 μL，50 μL磷酸盐缓冲液（1.2 mol/L K2HPO40.3 mol/L NaH2PO4， 5.80 mol/L TSP， 0.03 mol/L NaN3， pH=7.4），溶于5 mm的核磁共振样品管。称量TSP 0.73 mg， 以D2O配制的磷酸盐缓冲液（0.08 mol/L K2HPO4， 0.02 mol/L NaH2PO4， pH=7.4）溶解，并定容于2 mL容量瓶中，TSP浓度为2.12 mmol/L，用作尿液样品浓度测定时电信号内标法的参照样品。

2.3 NMR实验

NMR实验在Varian INOVA500谱仪上进行，1H共振频率为500.13 MHz，Varian双通道ID探头，实验温度25 ℃。反转恢复法[23]测定甘氨酸和TSP的T1值为3.4 和4.0 s。常规一维H谱实验采用PRESAT预饱和压水脉冲序列，脉宽为8.5 μs，预饱和压水2 s，采样点数64 k，谱宽8 kHz，弛豫延迟24 s，累加次数64。所有数据使用Bruker Topspin 2.0软件处理，FID在Fourier变换前填零至128 k，用0.3 Hz指数增宽处理，进行手动相位校正和基线校正。

2.4 实验方法

波形发生器（Waveform generator）[24，25]是Varian谱仪的基本组成部分，用于产生形状脉冲进行选择性激发。Varian谱仪的形状文件中每一行定义了波形发生器中每一步信号输出的幅度、相位和持续时间。Varian INOVA500谱仪波形发生器内存为64 k×32 bit，最大可允许64 k步的形状文件。

若形状文件定义每一步的幅度按指数衰减、相位线性增加，并持续时间相等，则波形发生器输出电信号就会与FID同样指数衰减，相位的线性变化会产生一定的频率偏置，从而实现电信号在频谱上位置的自由调整。该电信号由去耦通道产生，经过探头的13C线圈在采样期间发射，进入NMR谱仪的接收通路，从而在频谱上获得电信号内标的谱峰（图1）。形状文件定义的调制步数越多，每一步的持续时间越短，输出的电信号就越理想。本研究使用的形状文件调制步数为51200，能够满足实验的要求。可以用式（1）描述波形发生器的输出信号：A(t)=Ak·sin［ωIF·(t＋kts)＋φk］kts＜t≤(k+1)ts， k=0，1，2，3，……，Ｎs －１（１）其中，k表示形状调制文件的第k步，Ak是第k步的幅度，ωIF是波形发生器输出的中频频率（20 MHz）， ts为每一步调制的持续时间，φk是第k步的相位，Ns是形状文件的步数。如果要在谱仪采样期间产生类似FID的电信号，需要满足如下条件：Ａk=A0·e－kts/T2 φk=foffset·ktsAT=Ns·tsk=0，1，2，3，……，Ｎs－１(2)其中，A0是幅度调制的初值，可以认为是去耦通道的功率，T2是幅度指数衰减因子，一般要小于样品的横向弛豫时间。foffset是形状文件每一步相位线性增加对应的等效频率偏置，AT是采样时间，波形发生器输出电信号在采样期间进入谱仪的接收通路。

3 结果与讨论

3.1 电信号稳定性

电信号的稳定性直接影响电信号内标法进行定量测量的结果，在进行定量测量之前，要验证该电信号的稳定性。通过关闭功率放大器，使得样品的共振信号不在频谱上出现，由于去耦通道的电信号仍然在采样期间经过探头的13C线圈耦合进入谱仪的接收通路，因此，频谱上只有电信号内标的单峰，保持去耦通道功率（20 dB）和形状文件不变，多次重复实验，通过统计谱图上单峰积分，测试该电信号的稳定性。实验结果表明，该电信号幅度在－0.62%～0.60%范围内波动，多次测量的标准偏差是0.36%（图2）。电信号的波动源于谱仪电路部分的热噪声，波动幅度比较小则反映了谱仪去耦通道和波形发生器部分电路的稳定性。

3.2 NMR定量分析

NMR定量分析的原理是样品内确定核（以1H核为例）的共振信号积分强度与样品内该核的数量或者浓度成比例。如果已知浓度的参照样品和未知浓度样品在同等条件下进行NMR实验，就可以通过参照样品计算被测样品的浓度，可以用式（3）表示：ＩACA·NA=ＩＲＥＦCREF·NREF(3)其中，CA和CREF表示待分析样品和参照样品的浓度，NA和NREF表示待分析样品和参照样品对应基团的质子数，IA和IREF表示待分析样品和参照样品对应基团谱峰的积分面积。 对10组包含不同浓度甘氨酸和TSP的样品进行同样条件下的NMR实验，调整电信号内标的功率，使之与谱图中其它共振峰的强度相当。甘氨酸，TSP和电信号内标都是单峰，易于积分。根据不同样品的谱峰积分面积和质子浓度绘制曲线，可以发现积分面积与质子浓度呈较好的线性关系（图3，甘氨酸，R2=0.9982； TSP， R2=0.9962）。 电信号内标在不同样品中的积分近似水平直线，该直线与甘氨酸积分浓度直线的交点，即电信号内标所对应的等效质子浓度。通过一个参照样品计算出电信号内标的等效质子浓度，就可以通过电信号内标确定其它未知样品的浓度。 以第10个样品作为参照样品，分别以TSP和电信号作为内标，根据各样品谱峰积分面积和公式（3）计算甘氨酸的浓度（见表1）。结果表明，电信号内标与TSP作为内标定量分析的差别不大，测量结果相对样品配制浓度的偏差约为1%，因此，NMR电信号内标法可以取代传统的内标物定量分析方法。 为了描述样品的差异性，对每组样品分别计算积分质子浓度的比例系数（Proportionality coefficient，PC），即积分浓度曲线斜率。对各组样品的比例系数进行归一化处理，计算相对误差如下：PCA=IACA·ＮＡ ＲＥpc=PC－ＰＣＰＣ×１００％（４）其中，PCA表示分析物A的积分质子浓度比例系数，REpc（Relative error）表示各组样品中某分析物的比例系数的相对误差。分别计算各组样品中甘氨酸，TSP的相对误差以及电信号积分的相对误差，绘制相对误差随不同样品的变化曲线（图4）。表1 使用TSP和电信号内标测定甘氨酸的浓度（略）

结果表明，比例系数和电信号内标积分在不同样品的实验中存在4%的波动，可能是由于各组样品中离子浓度不同，影响了探头的调谐状态或者品质因数，从而在同等条件下，电信号从探头13C线圈耦合进入谱仪接收通路的程度不同造成的。但是可以看到各组样品中甘氨酸与TSP的积分相对误差和电信号积分相对误差同步变化，即各组样品计算的比例系数同步变化，尽管电信号内标在不同样品中波动较大（4%），但是由于这种同步变化导致浓度测量误差很小（约为1%，见表1）。

3.3 模型样品浓度的测定

人体尿液中代谢物的浓度比较低，有的代谢物浓度已经接近NMR的检测极限。为了验证电信号内标法对低浓度样品的测量误差，配置浓度在1 mmol/L水平的模型样品，主要包括葡萄糖，柠檬酸，丙氨酸，缬氨酸等常见代谢物，其中TSP溶于磷酸盐缓冲液中，用以确定化学位移。本研究中，由于低浓度模型样品和尿液样品等都是用相同的磷酸盐缓冲液配制的，样品离子浓度变化不大，对测定结果的影响可以忽略。电信号内标放置在谱图的左侧，化学位移δ为7.6。通过已知浓度参照样品得到电信号的等效质子浓度，然后测定模型样品中常见尿液代谢物浓度，多次测量求平均值。表2中列出了用于代谢物定量分析的化学基团的化学位移和多重性，计算得到的浓度，标准偏差以及测量数值与样品配置浓度的相对误差。结果表明，电信号内标法测定浓度在1 mmol/L水平的样品，误差约为5%，其中丙氨酸的误差较大（7.39%），明显大于本研究3.2部分中20 mmol/L以上的样品的测量结果；较小的标准偏差（<1.03%）说明测量结果具有好的重复性。对于低浓度样品来说，这样的测量误差是可以接受的，因此，本方法能够适用于浓度较低的尿液样品的定量分析。表2 电信号内标法测定模型样品的浓度（略）

3.4 人体尿液代谢物浓度的测定

分别对正常人和糖尿病患者尿液中代谢物浓度进行测定，样品制备如2.2所述。图5列出了人体尿液的一维1H谱和常见代谢物的谱峰归属，电信号经过调整放置在谱图的最左侧，化学位移δ（×１０６）为9.0。

表3列出了常见代谢物的浓度测定结果和测量的标准偏差。其中，参照样浓度中TSP浓度（5.80 mmol/L）是样品配制的浓度；肌酸酐（Creatinine）和葡萄糖（Glucose）的浓度是两个尿液样品在当地医院进行的生化检测的结果，检测设备为美国贝克曼库尔特有限公司的UniCel DxC 800 synchronron全自动生化分析系统。表3 电信号内标法测定人体尿液中代谢物的浓度（略） 实验结果表明，两个尿样通过NMR电信号内标法分别测定的TSP浓度（5.95和5.53 mmol/L）与样品配制的TSP浓度（5.80 mmol/L）相符合；测定的尿肌酐和葡萄糖的浓度与医院生化检测的结果也基本吻合。其中，正常人尿样的葡萄糖测定结果（0.35 mmol/L）与医院检测结果（0.64 mmol/L）相差较大，主要因为尿样中葡萄糖的含量较低，葡萄糖的共振峰信号强度已经接近噪声水平，而且从峰形分析，葡萄糖的谱峰可能与附近的其它小信号重叠（见图5b）。从总体上看，可以检测浓度1 mmol/L的物质， 如甲酸盐（Formate），葡萄糖（Glucose），马尿酸盐（Hippurate）等，定量检测结果的标准偏差较大。虽然当浓度接近NMR检测极限时，进行定量分析的误差随着浓度降低而增大，但是在本研究中NMR电信号内标法在人体尿液定量分析的误差并不很大，测量结果具有很好的重复性和可靠性，可用于复杂样品的定量分析。