绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析研究

作者：王元忠，刘鸿高，张金渝，李涛

【摘要】 目的建立绒柄牛肝菌的反相高效液相色谱定性和定量分析方法。方法反相高效液相色谱（RP-HPLC） Planetsil C18分析柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（15∶85），流速为1.0 ml·min-1，检测波长为261 nm，柱温为室温。对绒柄牛肝菌有效部位（甲醇提取部位）进行指纹图谱定性分析，对绒柄牛肝菌中的有效成分腺苷进行定量测定。结果在色谱条件下，11份不同绒柄牛肝菌中甲醇有效部位的RP-HPLC指纹图谱中可检出11个相对稳定的色谱峰，其中确定出9个共有峰作为定性鉴别的指标峰；绒柄牛肝菌中腺苷的含量为0.146%～0.493%。结论绒柄牛肝菌有效部位RP-HPLC指纹图谱定性和有效成分定量分析方法具有较强的针对性和准确性，可用于绒柄牛肝菌及药用真菌的质量控制。

【关键词】 绒柄牛肝菌； 腺苷； 指纹图谱； 反相高效液相色谱

绒柄牛肝菌Boletus tomentipes Earle，又名大巴菌、黑牛肝、毛脚牛肝菌，属于担子菌亚门（Basidiomyctina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricase）、牛肝菌科（Boletaceae）中的一种［1］。我国主要分布于云南，生于针阔叶林中地上，散生。全世界已知的牛肝菌属约有1 024种或变种，我国已知的可食用的就有199种［2］。据文献记载，牛肝菌子实体富含蛋白质、碳水化合物、钙、磷、铁、核黄素等营养成分，含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺嘌呤(adenine)、胆碱(choline)和腐胺(putrescine)等生物碱，可治疗腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐，还可治疗妇女白带症［3］ 。牛肝菌子实体的水提物对小鼠肉瘤S180的抑制率达90%，对艾氏腹水癌的抑制率为80%，是中成药“舒筋丸”的原料之一［4］。 众多研究表明，同一物种不同个体由于来源和产地不同，其有效成分含量会有很大差异［5～7］。为了确保绒柄牛肝菌药理作用，本研究建立了以绒柄牛肝菌有效部位为基础的HPLC指纹图谱定性分析和有效成分定量分析方法，并通过对11个不同地区的样品分析测定研究，确定了绒柄牛肝菌指纹图谱的共有峰和指标峰以及腺苷的含量范围，为有效准确地定性和定量鉴别不同来源的大型药用真菌提供一种分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Shimadzu LC-2010A高效液相色谱仪， SPD-M10Avp二极管阵列检测器， CLASS-VP色谱工作站；色谱柱为Planetsil-C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm) ；色谱柱恒温装置。超纯水器（Mill-Qplus USA）；KQ2200E型超声波仪（舒美超声仪）；AE100S万分之一电子天平（梅特勒－托利多）。

流动相甲醇为色谱纯（Fisher公司 美国）；水为三重蒸馏水（自制）；对照品腺苷（中国药品生物制品检定所提供）。其余所用试剂均为分析纯。

1.2 材料来源

见表1。表1 实验材料（略）

1.3 样品制备腺苷标准溶液：精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的腺苷标准品，加甲醇制成每毫升含20 μg的溶液，作为对照品溶液。 取样品粉碎混匀，准确称取0.500 0 g试样（精确至0.000 01 g）于心形瓶中，精密加90%甲醇10ml，70℃水浴回流提取30 min，放冷，再称定重量，用90%甲醇补足减失的重量，摇匀，以5 000 r/min离心5 min。经0.45 μm滤膜过滤后供液相色谱分析用。

2 结果

2.1 色谱条件色谱柱为Planetsil-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及其C18保护柱。流动相A为甲醇、流动相B为水；梯度洗脱；流速1 ml/min；检测波长261 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl。

2.2 分析方法学考察结果

2.2.1 系统适应性实验吸取对照品溶液5 μl注入色谱仪，记录色谱图，理论塔板数按腺苷计算在5 000以上。在此条件下对腺苷对照品溶液，供试品溶液进行测定，供试品溶液色谱图中与对照品溶液色谱图相同位置具有吸收峰，且对照品测定无干扰。

2.2.2 线性关系考察

精密吸取2，4，6，8，10，12，14，16μl腺苷对照品溶液，按上述条件分别进样，以腺苷浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：Y=1.46×106 X-1.22×105，r2 =0.999 69，(n = 7)，表明腺苷在1.2～ 96 μg/ml范围呈良好的线性关系。

2.2.3 仪器精密度和对照品溶液稳定性实验精密吸取腺苷对照品溶液，在上述条件分别进样6次，计算腺苷的峰面积，RSD＝0.678％，表明仪器精密度良好。 精密吸取腺苷对照品溶液，于配制后的0，2，4，8，14，26，48 h测定，其峰面积RSD＝1.04％，表明腺苷对照品溶液在48 h内稳定。

2.2.4 样品溶液的稳定性实验取同一批号的样品，分别在0，2，4，8，14，26，48 h检测指纹图谱，各色谱峰的相对保留时间无明显变化，单峰面积占总峰面积5％以上的色谱峰与参照峰的峰面积比值也无显著变化。RSD＝1.454％，表明样品溶液在48 h内稳定；仪器精密度可靠，符合指纹图谱要求（国家药监局，2000）。

2.3 指纹图谱的建立分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪中，记录60 min色谱图即得。比较11批供试品的HPLC图谱发现，其中有6个色谱峰是11批供试品所共有的。计算图谱中各共有峰色谱峰相对于腺苷色谱峰（3号峰）的相对保留时间（a=ti/t8）和相对峰面积值（AR=Ai/A总×100%）。结果见表2～3。表2 不同地区绒柄牛肝菌HPLC图谱主要峰相对保留时间比较（略）表3 不同地区绒柄牛肝菌HPLC图谱主要峰相对保留时间比较（略）

2.4 共有峰确定在11份绒柄牛肝菌供试样品的HPLC图谱中，由色谱峰相对保留时间（a）的稳定性（相对偏差小于3%），可以确定的共有峰有9个，其相对保留时间从0.108 ～ 2.180；同时分别计算11个样本主要峰的总面积（A总）、平均总面积（a总）以及总面积的相对偏差，舍去总面积相对偏差小于-40%的（样品编号为3，4，10），最后其余样本确定绒布牛肝菌共有峰1，3，5，6，7，8，9，10，11号峰，作为绒柄牛肝菌指纹图谱定性分析的指标峰。用此定性指标鉴定11样本，结果所有样本均为绒柄牛肝菌。

2.5 绒柄牛肝菌中腺苷含量测定按“1.3”方法处理，进样5 μl分析，测得峰面积积分值，计算绒柄牛肝菌中腺苷含量。结果见表4。

3 讨论 RP-HPLC法虽然是一种有效的分离分析方法，但由于绒柄牛肝菌成分复杂，性质各异，即使使用梯度洗脱也很难获得理想的分离结果。使用梯度洗脱增加了实验操作和重现性难度，而且难以突出地反映药用真菌与主要药理作用相关的有效成分群，从而在质量控制方面无法有效地做到“纲举目张”。本实验应用反相高效液相色谱技术，建立了以绒柄牛肝菌指纹图谱定性和有效成分定量的分析方法。这种方法是在物质基础上，以绒柄牛肝菌为质控对象，并利用现代仪器分析技术同时进行定性和定量分析，增强了方法的有效性和针对性。实验中采用等度洗脱方式，色谱条件容易控制，可保证分析结果的重复性。表4 不同地区绒柄牛肝菌中腺苷含量测定结果（略） 在色谱条件下，绒柄牛肝菌的HPLC图谱中可以检出11个色谱峰。通过对11份绒柄牛肝菌供试样品的HPLC图谱中主要峰相对保留时间（a）分析，其相对误差（RSD）均小于3%，表明主要色谱峰在HPLC图谱中的相对位置是稳定的，可以作为定性鉴别的指标参数；同时，测定各样本主要峰的总面积（A总），以反映在不同样本中的绝对含量，而各总面积的相对偏差则可以比较在不同样本中的相对含量，舍去相对含量较小的样本，由其余样本确定了绒柄牛肝菌定性鉴别的指标峰有9个，相对保留时间分别为0.108，0.291，0.568，0.667，0.710，1，1.156，1.470，2.180，将其用于对11个样本的定性鉴别。结果表明，虽然11个样本中腺苷在含量上差别很大，但均含有9个指标峰，故认为它们是绒柄牛肝菌。 本研究选用腺苷作为标准品，据文献资料报道，腺苷在大型真菌中的相对含量较为适中；腺苷为辅酶类药物，它能参与体内能量代谢及蛋白质的合成，具有提高各种酶(特别是辅酶A) 的活性及改善机体代谢作用，因此是生物体生长代谢所必须、普遍存在的物质，以其作为标准品具有可比性。

在本实验中，我们将11个样本在相同实验条件下，以腺苷为对照品，通过HPLC检测出的腺苷成分含量在0.146%～0.493%之间。表明不同生长环境和贮藏时间对有效成分含量影响很大，绒柄牛肝菌质量须严格控制。在有效成分不完全明确的前提下，制定药用真菌的指纹图谱，对于有效地控制其质量，具有重要意义。 由于大型药用真菌所含化学成分多而复杂，其来源品种、产地、生长过程、采收时间、储藏条件等诸多因素对质量都有一定影响。大型药用真菌质量的传统评价方法已经不能满足质量评价的需要，因此采用现代的科学技术建立大型药用真菌定性定量标准已经非常必要和迫切。