薄层色谱成像法定量分析何首乌中大黄素的含量

作者：蔡力行 戈早川 赖小辉

【摘要】 目的研究用薄层色谱成像方法测定何首乌中大黄素的含量。方法以正己烷-醋酸乙酯-甲酸（15∶3∶0.3）为展开剂，以硅胶G为固定相展开大黄素标准样品和何首乌抽提液，用色谱成像系统处理薄层斑点，将斑点信息转换成谱峰信息进行定量。结果大黄素标准工作曲线在0.2～1.0 μg范围内呈线性，相关系数r＝0.993。何首乌样品中大黄素含量为0.184 mg/g，RSD为1.0%，回收率100.9%，RSD为3.3%。结论 薄层色谱成像法可以应用于何首乌药材的质量管理控制，配合相应的展开系统可以推广至许多应用领域。

【关键词】 何首乌 大黄素 定量分析 薄层色谱成像

中药材何首乌为蓼科植物何首乌的干燥块根，具有解毒、消痈、润肠通便的功能，可用于治疗瘰疬疮痈、风疹瘙痒、肠燥便秘和高脂血症。何首乌主要的化学成分为：大黄素（emodin）、大黄酚（chrysophanol）、大黄素甲醚（physcion）、大黄素-1，6-二甲醚(emodin-1，6-dimethylether)、大黄素-8-甲醚(questin)、ω-羟基大黄素(citreorosein)、ω-羟基大黄素-8-甲醚(questinol)、2-乙酰基大黄素(2-acetylemodin)、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(emodin-8-O-β-D-glucoside)、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷(Physcion-8-O-β-D-glucoside)等。其中大黄素是一种羟基蒽醌的衍生物。分子式C15H10O5。橙色针状晶体，熔点256～257℃；不溶于水，能溶于乙醇，稍溶于乙醚、氯仿、苯。 常用的何首乌及其制剂含量测定方法有：薄层色谱法、高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法、高效毛细管电泳法、荧光分光光度法、酶化学发光法和流动注射化学发光法等［1］。吴琳［2］用甲醇、水加乙醇加盐酸混合液和氯仿水浴回流提取，点于含0.3%CMC-Na硅胶G薄层板，用苯-甲醇-甲酸（3∶0.3∶0.05）展开，扫描波长430 nm，测定何首乌中大黄素含量，加样回收率96.13%。张玉华等［3］用95%乙醇索氏提取，点于同一硅胶G板，用石油醚∶正己烷∶醋酸乙酯∶甲酸（1∶3∶1.5∶0.1）展开，用甲醇洗脱，加1%醋酸镁-甲醇液显色，用分光光度计于波长512 nm处测定吸收值，测定何首乌中大黄素含量。本实验采用薄层色谱成像法定量分析何首乌中大黄素的含量。现报道如下。

1 仪器与试剂 GOODLOOK-1000型薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司）及SnigIt 8 软件（TechSmith公司）。KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。硅胶G薄层板（青岛海洋化工有限公司）。正己烷，醋酸乙酯，甲醇，甲酸（均为分析纯）。大黄素标准对照品（购于中国药品生物制品检定所）。中药材何首乌（购于广东本草药业连锁有限公司学府路分店），药材经深圳市药品检验所熊英高级工程师鉴定确为制何首乌Polygonum multiflorum Thunb.。

2 方法

2.1 薄层条件薄层板为硅胶G；展开剂为正己烷-醋酸乙酯-甲酸（15∶3∶0.3，V/V/V）。用微量注射器吸取何首乌供试品溶液，在胶硅G薄层（点样前在烘箱中于110℃活化1 h）的下端1.0 cm的基线上点样，点间距离为0.8 cm，点样后自然晾干。取展开剂置于层析缸中，将点样后的薄层板放入层析缸中内，预先平衡15 min.后再进行上行展开7 cm，将薄层取出，吹干，待测。

2.2 样品制备

2.2.1 何首乌供试品溶液的配制将何首乌100 g药材置于烘箱中65℃烘干3 h，再放入干燥器中冷却。随机取约80 g用手提式中药粉碎机粉碎，粉末过200目筛，入无色广口瓶保存。称取过筛后的何首乌粉末各25 g，加250 ml甲醇用超声提取器30 min，蒸发浓缩，再将浓缩液转移到10 ml容量瓶中，用甲醇定容，得何首乌供试品溶液，10℃以下保存备用。

2.2.2 大黄素对照品溶液的配制精确称取0.005 0 g的大黄素标准对照品，加入甲醇溶解，置于10 ml容量瓶中定容，配成0.50 mg/ml大黄素标准对照品溶液，放置10℃以下保存备用。

2.2.3 加标溶液的配制在1 ml供试品溶液中加入1 ml 0.50 mg/ml大黄素对照品溶液，得加标溶液。

2.3 薄层斑点的成像及峰面积计算方法用薄层成像系统处理展开后的薄层板，再用Snagit 8软件抓取色谱峰图象，保存后打开，利用软件抓图时的坐标量取峰高和半峰宽度两端坐标，峰面积等于峰高乘半峰宽度。

3 结果

3.1 大黄素定量分析的标准曲线分别取大黄素标准对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6和2.0 μl从左到右点于同一薄层板上，展开。用薄层色谱成像系统拍摄展开后的薄层，然后利用薄层色谱成像系统生成色谱峰，见图1。以峰面积对点样量作图，得到大黄素的标准曲线，见图2。大黄素标准曲线在0.2～1.0 μg范围内呈线性，相关系数r=0.996。

3.2 何首乌中大黄素的含量测定采用外标两点法进行薄层色谱定量。分别取大黄素标准溶液0.4 μl，何首乌供试品溶液1.0 μl和大黄素标准溶液1.2 μl从左到右依次点于同一薄层板上，展开。平行展开分离3份，编号分别为A，B和C。用薄层色谱成像系统拍摄展开后的薄层，并处理成相应的色谱峰（见图3）。由峰面积用外标两点法计算。结果见表1。

表1 何首乌中大黄素含量测定数据（略）

3.3 加样回收率分别取大黄素标准溶液0.4 μl。加标供试品溶液1.0 μl，大黄素标准溶液1.2 μl，从左到右依次点于同一薄层板上，展开。平行展开3份，编号分别为A，B，C。用薄层色谱成像系统拍摄展开后的薄层，利用薄层色谱成像系统得到相应的色谱峰，如图4。由峰面积用外标两点法计算。结果见表2。

表2 回收率测定数据（略）

图1 大黄素标准曲线的色谱峰（略）

图2 大黄素的标准工作曲线（略）

图3 何首乌中大黄素含量测定的色谱峰（略）

图4 回收率测定的色谱峰（略）

4 讨论 以硅胶G为固定相，以正己烷-醋酸乙酯-甲酸（15∶3∶0.3，V/V/V）为展开剂，分离后的大黄素斑点呈圆形，Rf 值适当。大黄素斑点用薄层色谱成像系统转换处理成色谱峰，可用于定量分析；大黄素标准曲线在0.2～1.0 μg范围内呈线性，相关系数0.993；所测样品何首乌中大黄素含量为0.184 mg/g，RSD为1.0%；方法加样回收率100.9%，RSD为3.3%。薄层色谱成像法适用于何首乌中大黄素的含量测定，并可推广至许多应用领域。 在通常的薄层色谱方法中，样品经分离后要采用薄层扫描仪扫描定量。本实验的创新之处在于用薄层色谱分离了何首乌样品后，采用薄层色谱成像系统将分离的斑点转换处理成色谱峰。经实验，在一定浓度范围内色谱峰面积与大黄素点样量呈良好的线性关系。本实验建立何首乌中大黄素的薄层色谱成像分析法，该法既无须借助薄层扫描仪又承继了薄层色谱简便易行的特点，值得推广使用。