乳腺癌患者肿瘤循环DNA的定量分析

作者：今毅 谢文 余小萍 郑晖

【摘要】 目的：检测乳腺癌患者肿瘤循环DNA的含量及其p16基因5′ CpG岛甲基化状态的改变. 方法：收集61例乳腺癌患者、33例乳腺良性病变患者和27例健康志愿者的血浆样本，抽提血浆循环DNA，以SYBR green I荧光染色法行DNA定量；利用半巢式甲基化特异性PCR技术，检测61例乳腺癌患者血浆循环DNA和相应癌组织p16基因5′ CpG岛甲基化状态的改变. 结果：乳腺癌患者、乳腺良性病变患者、健康自愿者肿瘤循环DNA浓度分别为（65.0±45.3）， (19.0±9.5)和(13.0±7.3) μg/L，乳腺癌患者血浆循环DNA浓度显著高于乳腺良性病变患者和健康自愿者，差异有统计学意义(P<0.05). 61例乳腺癌患者血浆循环DNA和相应癌组织p16基因5′ CpG岛甲基化状态的改变检出率分别为44.3%和46.2%，两者检出率无统计学差别(P>0.05). 结论：血浆肿瘤循环DNA的定量有可能成为一种新的恶性肿瘤标志物.

【关键词】 乳腺肿瘤 DNA 肿瘤 p16基因 甲基化 肿瘤标志 生物学

0引言

随着近年来肿瘤细胞生物学及分子生物学的深入研究，以及分子生物学检测技术的快速发展，外周血肿瘤标记由于检测的方便和非侵入性己逐步替代了受到标本采集以及无法连续监测和随访追踪等诸多限制的组织学肿瘤标记. 而外周血循环DNA及其改变的分子生物学检测正以其不可替代的优点逐渐被人们所重视，并成为肿瘤细胞生物学及分子生物学研究中引人注目的一个亮点［1-4］. 循环DNA是存在于血清和血浆中的游离DNA. 近年来，日益增多的研究表明，肿瘤在生长过程中能持续释放肿瘤细胞DNA进入外周血液. 健康人体的血清及血浆中只含有极少量的循环DNA，在炎症及肿瘤患者外周血中循环DNA的浓度增加，伴有转移的肿瘤患者其浓度更高于早期患者［5-7］. 对循环肿瘤DNA的检测可分为定性和定量两种：前者主要检测血清和血浆中肿瘤特异性基因的改变，后者则检测血清和血浆的DNA总量，两者均可反映肿瘤的存在和严重程度. 我们从定量（检测肿瘤循环DNA的含量）和定性（检测肿瘤循环DNA的p16基因5′ CpG岛甲基化状态的改变）两方面入手，对乳腺癌患者肿瘤循环DNA含量及其p16基因5′ CpG岛甲基化状态的改变进行了研究.

1对象和方法

1.1对象武汉大学中南医院妇瘤科和肿瘤科在200508/200605收治的61例乳腺癌患者，诊断均经组织病理学证实. 33例乳腺良性病变患者为本院妇产科同一时期收治的，排除其他病变. 27健康对照来自本院体检中心，体检正常，无疾病在身. QIAamp DNA Blood Midi Kit购自Qiagen公司， 荧光染料SYBR green I购自Molecular Probes公司，标准量DNA购自Invitrogen公司， Wizard DNA Purification Resin购自Promega公司， PCR扩增仪为BIORAD公司，电泳仪、凝胶成相系统为北京六一电子仪器设备厂， FR2200紫外投射仪与可见分析装置为上海复日科技有限公司产品.

1.2方法

1.2.1样本收集所有乳腺癌病例取静脉血5 mL置于EDTA抗凝管中，以3000 r/min，离心10 min后将上清血浆部分吸至洁净离心管，再离心10 min，完全去除血细胞成分后置于干燥洁净冻存管中，-80℃低温冰箱保存备DNA抽提. 相同方法采集保存33例乳腺良性病变、27名健康志愿者的血液样本.

1.2.2血浆DNA抽提和纯化血浆DNA的抽提严格按照QIAamp DNA Blood Midi Kit(Qiagen公司，德国)试剂盒的操作步骤进行，每2 mL血浆获得300 μL的DNA. 所有保存血浆标本均采用同一批号的试剂盒抽提DNA以减少批间误差并统一集中检测.

1.2.3血浆DNA定量取10 μL血浆DNA置透明载板，与1∶3000荧光染料SYBR green I (Molecular Probes公司，美国)等比例稀释并充分混匀后置于紫外与可见光成像分析系统中，在激发光波长为345 nm， 吸收波长500 nm的条件下，摄影获取图像，经软件系统分析读取其发光强度. 将检测所得不同样本DNA的发光强度代入根据标准含量DNA的发光强度所作的回归方程，分别计算出其相应的DNA浓度. 如果样本发光强度超过标准DNA发光强度范围，则将样本稀释后再进行定量，直到所测值在标准浓度范围内. 每次对同一血浆样本检测3次，取其平均值.

1.2.4肿瘤组织DNA的提取取约0.5 g冷冻组织立即放入液氮中磨碎成粉末状， 加入到10倍体积的DNA抽提缓冲液中，边加边摇，混匀后置于50℃水浴1 h，再加蛋白酶K至终浓度为100 mg/L放入50℃水浴3 h，根据水解情况确定是否再加. 全溶解后加蛋白酶(终浓度20 mg/L) 37℃水浴1 h， 以等体积的饱和酚来回轻轻颠倒10 min， 4000 r/min离心10 min， 吸取上清至另一塑料管中，然后以酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶异戊醇(24∶1)比例各抽提一次. 加1/10体积的3 mol/L乙酸钠及2~2.5倍体积的冰乙醇沉淀DNA，然后用700 mL/L (V/V)乙醇洗涤DNA 3次，室温下干燥，加适量TE溶解. DNA -20℃下保存， 以作为模板DNA扩增.

1.2.5引物设计引物序列： U 上游 5′TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TGT 3′，下游 5′CAA CCC CAA ACC ACA ACC ATA A 3′； M上游 5′TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CGC 3′，下游 5′GAC CCC GAA ACC GCG ACC GTA A 3′; 其中U为非甲基化引物，M为甲基化引物.

1.2.6DNA甲基化修饰和纯化取己提取的血浆或肿瘤组织DNA 50 μL， 加入50 μL 0.2 mol/L NaOH， 于37℃变性10 min， 加入10 mmol/L对苯二酚30 μL， 再加入520 μL 3 mol/L NaHSO3， 50℃水浴16 h进行甲基化修饰， 水浴完毕后准备纯化DNA. 甲基化修饰后的DNA采用Wizard DNA Purification Resin(Promega公司) 纯化试剂盒，严格按照试剂盒操作步骤进行.

1.2.7半巢式甲基化特异性PCR反应PCR反应体系: Taq DNA聚合酶25 μL， 模板DNA 2.5 ng， 引物1 (20 μmol/L) 1 μL， 引物2 ( 20 μmol/L) 1 μL， 200 μmol/L dNTPs 1 μL， 灭菌蒸馏水加至50 μL. PCR反应条件: 95℃ 12 min; 95℃ 45 s， 60℃ 45 s， 72℃ 60 s共35个循环 ; 72℃延长10 min.

统计学处理: 全部资料用SPSS 11.0软件分析，计数资料采用χ2检验进行组间比较，计量资料采用非参数秩和检验，P<0.05为有统计学意义.

2结果

2.1血浆循环DNA浓度的检测乳腺癌患者为（65.0±45.3） μg/L， 乳腺良性病变患者(19.0±9.5) μg/L， 健康自愿者(13.0±7.3) μg/L. 乳腺癌患者血浆循环DNA浓度显著高于乳腺良性病变患者和健康自愿者，差异在统计学上有显著性(P<0.05).

2.2血浆循环DNA浓度作为乳腺癌诊断标准的敏感度及特异度应用受试者工作特性曲线(ROC)对乳腺癌患者组和两对照组(乳腺良性病变组、健康自愿者组)进行了分析. 采用19 μg/L作为诊断乳腺癌的临界值， 结果显示在健康人群中检测乳腺癌的敏感度为95.1%， 特异度为88.9%， ROC曲线下面积(AUC)为0.946，95%CI为0.876~0.983 (图1). 采用22 μg/L作为诊断乳腺癌的临界值， 结果显示在乳腺良性病变人群中检测乳腺癌的敏感度为93.4%， 特异度为66.7%， AUC为0.845， 95%CI为0.756~0.912 (图1).

2.3乳腺癌患者血浆循环DNA p16基因5′ CpG岛甲基化状态改变的检测为了证实血浆肿瘤循环DNA的特性，我们对61例乳腺癌患者血浆循环DNA的p16基因5′ CpG岛甲基化状态变化进行了检测. 半巢式甲基化特异性PCR分析结果显示: 61例乳腺癌患者血浆循环DNA有27例p16基因5′ CpG岛甲基化， 甲基化率44.3%， 其相应的肿瘤组织DNA有28例p16基因5′ CpG岛甲基化， 甲基化率46.2%， 两者检出率无统计学差别(P>0.05). 血浆循环DNA具有肿瘤特性的相关基因.

3讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，治疗上早期诊断是一个关键环节. 血中游离DNA和p16基因5′ CpG岛甲基化的检测为乳腺肿瘤的早期诊断提供了一种新的简便途径.

已证实肿瘤患者血清DNA水平大大高于正常人［8-9］. 研究表明乳腺癌在发生过程中除DNA序列改变外，DNA甲基化的表遗传性的改变早于恶性表型的出现并且具有肿瘤的独特性，启动子的高甲基化是抑癌P16基因在乳腺肿瘤中失活的机制之一. 本实验中61例乳腺癌患者血浆循环DNA及其相应的肿瘤组织DNA甲基化检出率分别为44.3%和46.2%， 两者检出率无统计学差别(P>0.05). 这证明p16基因5′ CpG岛甲基化状态具有肿瘤特异性，并且循环血中DNA和肿瘤组织中表达的基因一致.

本实验我们采用SYBR green I荧光染色法研究了不同组别血浆循环DNA的浓度. 结果显示: 乳腺癌患者血浆循环DNA浓度（65.0±45.3） μg/L显著高于乳腺良性病变患者(19.0±9.5) μg/L和健康自愿者(13.0±7.3) μg/L，差异在统计学上有显著性(P<0.05). 上述结果表明， 与正常对照组相比，恶性肿瘤患者循环DNA水平明显升高， 循环DNA的含量检测对肿瘤的诊断有一定的价值，其可能是肿瘤诊断的一个重要生物学指标.

本研究我们构建了ROC曲线来评价循环DNA定量的敏感度及特异度，以此确定诊断乳腺癌的截断(cutof)值. 结果发现: 分别采用19 μg/L和22 μg/L作为正常人群组和具有高危性的乳腺良性病变患者组诊断乳腺癌的临界值时， 敏感度及特异度各不相同. 因此， 循环DNA检测适合作为临床诊断乳腺癌指标，但在不同受试人群中需根据检查目的使用不同的截断(cutoff)值.

以循环DNA为基础的核酸分析对于探测肿瘤特异的细胞外DNA， 是一种新的、有潜在价值的癌症检测和监测方法. 当然，迄今仍没有足够的证据显示［10］，细胞外核酸能代替细胞内. 但循环中的癌基因或相关DNA的检测对于癌症的筛选、诊断和监测有重要的意义， 血浆肿瘤循环DNA有可能成为一种新的恶性肿瘤标志物.