DNA定量分析用于宫颈癌及癌前病变的早期筛查探讨

作者：张薇，刘玉华，易细容，周单华

【摘要】 ［目的］ 探讨用DNA定量分析和常规细胞学相结合方法而诊断宫颈癌及癌前病变。［方法］ 对3266名妇女用宫颈刷取材，每例液基薄层制片2张，1张巴氏染色做常规细胞学检查，1张Feulgan DNA染色用全自动DNA倍体分析系统做DNA定量测定。常规细胞学和DNA倍体分析系统可疑的妇女在阴道镜下行宫颈组织学活检。［结果］ 3266例宫颈癌标本中，常规细胞学发现42例非典型鳞状上皮（ASCUS），9例低级别鳞状上皮内病变（LSIL）及1例高级别鳞状上皮内病变（HSIL）。DNA倍体分析发现3个或3个以上＞5C细胞的35例。32例活检病例中有14例宫颈上皮内瘤变2（CIN2）或CIN2以上级别改变，这14例细胞标本中均可见DNA倍体异常，而常规细胞学发现1例正常，8例ASCUS，4例LSIL和1例HSIL。［结论］ DNA倍体分析与常规细胞学相结合方法可提高宫颈癌及癌前病变的阳性率。

【关键词】 宫颈肿瘤 宫颈上皮内瘤变

Screening for Early Cervical Cancer and Precancerous Cervical Lesions by DNA Ploid Analysis

Abstract: ［Purpose］ To explore the diagnosis for cervical cancer and precancerous cervical lesions by DNA ploid analysis combined with cytology. ［Methods］ A total of 3266 cervical samples were obtained by cervix brush. Cell monolayers were prepared by a liquid based sample preparation. Two slides were prepared from each case: one slide was stained by Papanicolaou stain for conventional cytology examination， while the other slide was stained by Feulgen-Thionin method to measure relative amount of DNA in cell nuclei using an automated DNA imaging cytometer. Women suspected by cytology and DNA ploid underwent a colposcope examination and biopsy. ［Results］ Forty-two cases proved atypical squamous cells of undermined significance (ASCUS) by cytology; 9 cases， low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL); and 1 case， high-grade squamous intraepithelial lesion(HISL) were found， while DNA ploid analysis found 35 cases having 3 or more cells with DNA greater than 5C in a total of 3266 women. Fourteen cases with cervical intraepithelial neoplasia 2(CIN2 or over） out of 32 biopsies were diagnosed as 1 case， normal; 8 cases， ASCUS; 4 cases， LSIL and 1 case， HSIL by cytology. However all 14 cases were determined aneuploid cells by a DNA image cytometry. ［Conclusion］ Combination of DNA ploid analysis and cytology can increase positive rate of detection for cervical cancer and precancerous cervical lesions.

Key words：DNA ploid; cytology; cervical neoplasms; cervical intraepithelial neoplasia

宫颈癌是妇科高发的恶性肿瘤之一，宫颈癌及癌前病变的早期筛查与早期治疗是防治宫颈癌的主要手段。宫颈细胞学检查简便、可靠，是目前推行最广、最有成效的防癌筛查方法。但在传统的宫颈细胞学检查过程中可出现：取材时细胞丢失和制片时涂片质量差、人眼工作疲劳等问题，往往会影响细胞病理学医生的正确诊断而导致较高的假阴性。近年来，我们采用宫颈刷取材，液基薄层制片，有经验的细胞学医生与全自动DNA图像分析系统相联合，力求把宫颈癌及癌前病变的漏诊率降低到最低限度。目前，DNA倍体分析系统进行宫颈癌前病变的诊断及预测在国内外已有大量报道[1~3]。在北美及欧洲细胞DNA定量分析诊断方法已是一种常见临床检测方法之一[4，5]。本研究主要探讨用宫颈常规细胞学结合全自动DNA图像分析系统诊断宫颈癌及癌前病变。

1 材料与方法

2005年10月至2006年5月，3 266名妇女在本院进行宫颈癌筛查。参与检查妇女的年龄多数在22~62岁。宫颈癌普查试剂盒由武汉兰丁肿瘤早期诊断检测中心提供，其中包括：宫颈刷、盛有固定液的标本管、标签、申请单等。

1.1 取 材

妇科医生在阴道扩张器直视下，手持宫颈刷的刷柄，通过扩阴器，将刷头中央较长的刷丝从子宫颈外口插入子宫颈管内（约8mm）处，周边刷丝顶部抵触于子宫颈黏膜面，顺时针或逆时针旋转3~5圈，取出宫颈刷后，用镊子夹紧刷头底座，拔脱刷头，将刷尖向下垂直方向浸泡在样本收集管固定液内，旋紧管盖后震荡摇晃，然后将贴上标签的标本管送到细胞实验室制片。

1.2 液基薄层制片及染色

将装有固定液和刷头的标本收集管，经化学和物理处理，每例制成2张薄层细胞学片。其中1张巴氏染色做常规细胞学诊断，另外1张Feulgen DNA染色做DNA定量测定。

1.3 细胞学诊断

所有巴氏染色片经有经验的细胞病理医生读片。根据Bethesda诊断分为5组：①正常或良性；②不明意义的非典型鳞状上皮(typical squamous cells of undermined significance，ASCUS)；③低级别鳞状上皮内病变(low?鄄grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)；④高级别鳞状上皮内病变(high?鄄grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)或原位癌(carcinoma in sita，CIS)；⑤鳞状上皮浸润癌。

1.4 细胞DNA定量分析

所有Feulgen染色片用AcCell全自动细胞图像分析系统进行扫描处理[6，7]，该系统已达到欧洲定量细胞病理学会所制定的有关DNA定量分析图像系统的各项标准[8]。一般情况下，AcCell系统对每张玻片上6 000个以上的细胞核进行扫描测定。经扫描后的每个细胞核均有128个特征值，其中包括形态特征、吸光特征、具体结构特征、Markovian和非Markovian结构特征和长度特征等。AcCell系统根据不同细胞成分所具有的不同特征参数来完成自动细胞分类和计数过程，如正常上皮细胞，增生或癌变细胞，淋巴细胞，中性白细胞及未参与诊断的垃圾细胞（重叠细胞核，聚焦不良细胞核和核碎片等）。标准对照细胞为同张玻片上的100个正常上皮细胞，所测出的平均光密度(intergrated optical density，IOD)为2C的参考值，其CV（coefficient of variantion）值＜5%。如果出现以下三种情况就诊断异常：①出现5C（DNA指数＞2.5）非整倍细胞。②4C细胞数超过被测细胞总数的10%。③出现非整倍体细胞峰。

凡是有DNA指数＞2.5以上细胞的玻片，都要通过细胞技术员在显微镜下逐一对DNA指数＞2.5细胞进行核实，以排除AcCell系统将垃圾和重叠的细胞核误认为癌细胞或异常细胞。

1.5 结合常规细胞学与DNA定量分析

根据表1而做出综合诊断及建议。

1.6 阴道镜及病理学检查

凡建议活检妇女，均建议进行阴道镜检查并对宫颈可疑部位进行四点以上的组织活检。每例活检样本由有经验的病理学医生出病理诊断报告。病理诊断报告分别为正常、宫颈炎、宫颈上皮内瘤变（CIN1、CIN2、CIN3）或原位癌和浸润癌。

2 结 果

2.1 常规细胞学与DNA倍体分析比较

3 266名妇女中，常规细胞学诊断3 214例正常，42例ASCUS、9例LSIL及1例HSIL；DNA倍体分析发现3 117例未见非整倍体细胞，114例1~2个＞5C非整倍体细胞，27例3~10个＞5C非整倍体细胞和8例10个或10个以上＞5C非整倍体细胞。在42例ASCUS病例中，除2例ASCUS和1例LSIL外，其余ASCUS，LSIL和HSIL均可见非整倍体细胞。在114例1~2个非整倍体细胞病例中，89例常规诊断为正常，其余25例分别诊断为ASCUS和LSIL。在27例3~10个＞5C细胞病例中，有11例常规诊断正常，16例诊断为ASCUS或LSIL。在8例大于10个＞5C细胞病例中，常规均诊断为ASCUS、LSIL或HSIL。

表2中常规细胞和DNA倍体分析均为正常3 114例，常规细胞学诊断正常而DNA发现1~2个＞5C细胞89例和常规诊断为ASCUS而DNA分析正常的2例，未要求活检，其余的61例均要求活检。

2.2 病理学诊断与DNA倍体分析和常规细胞学比较

有61例妇女要求活检，但在本院实际活检例数为32例。32例病理检查发现1例为宫颈炎，17例CIN1，7例CIN2，6例CIN3/CIS和1例浸润癌。

表3显示，在1例宫颈炎中DNA倍体分析发现有3~10个大于5C细胞（常规诊断为ASCUS）。在17例CIN1中有1例DNA倍体分析正常，而常规诊断为LSIL，其余16例均可见DNA倍体异常。在7例CIN2、6例CIN3/CIS和1例浸润癌中均可见DNA倍体异常。

在18例病理诊断为宫颈炎和CIN1病例中，有常规细胞学分别诊断为2例正常，12例ASCUS，3例LSIL。在14例病理诊断为CIN2、CIN3/CIS和浸润癌的病例中，常规细胞学分别诊断为1例正常，8例ASCUS，4例LSIL和1例HSIL。

2.3 敏感性

若以病理学诊断为金标准，计算常规细胞学和DNA倍体分析诊断CIN2或CIN2以上级别的敏感性。若以ASCUS和LSIL诊断作为活检发现CIN2或CIN2以上级别的敏感性为92.9%和35.7%。而若以发现1个以上、3个以上和10个以上非整倍体细胞作为活检而发现CIN2或CIN2以上级别的敏感性分别为100%、92.9%和21.4%。

3 讨 论

临床上对宫颈常规细胞学诊断为ASCUS患者较难处理，由于这类患者的活检阳性率低，往往要求这类患者半年内复查。本文对21例ASCUS伴DNA倍体异常患者进行活检可发现12例CIN1、4例CIN2、3例CIN3/原位癌及1例浸润癌。提示此类型患者多伴有病理性改变，故有学者建议ASCUS伴有DNA非整倍体者须进一步活检，而ASCUS伴有整倍体者多视为正常而不要求进一步活检。本文还证实在3例常规细胞学正常而伴有多个非整倍体细胞患者均有病理性改变（2例CIN1、1例CIN2）。这都说明宫颈细胞中出现非整倍体细胞，均要提高警惕。

有报道证实大多浸润性宫颈癌均有染色体异常改变，在CIN2、CIN3/CIS和浸润癌病例中分别有59%、84%和87%有异倍体细胞出现[9]。本文中14例CIN2或CIN2以上的病例均可见细胞DNA倍体异常。

为什么宫颈癌及癌前病变可出现非整倍体细胞呢？这与HPV感染密切相关，Duensing等[10]研究发现高危型HPV感染可引起染色体异常有两条途径：①通过病毒上的E7影响细胞周期过程中心粒一分为二的过程。②E6通过抑制p53在细胞周期中的作用位点[11]。

若以LSIL作为活检标准而发现CIN2 以上病变的敏感性为36%，而以3个或3个以上异倍体细胞作为活检标准的敏感性为93%。有报道证实LSIL的敏感性为63%，而以3个或3个以上异倍体细胞作为活检标准的敏感性为90%[3]。从本文资料来看，将常规细胞学与DNA倍体方法结合起来，综合诊断其敏感性可达100%。

综上，用DNA倍体分析方法来检测宫颈癌及癌前病变是一种新的尝试，从本文的资料可见DNA倍体分析与常规细胞学相结合可提高宫颈癌及癌前病变的检出率。

致谢：武汉兰丁肿瘤早期诊断检测中心汪键博士对本文进行的指导，李耀辉小姐对本文的帮助。