多重耐药肺炎克雷伯菌氨基糖苷类药物耐药相关基因研究

作者：戴学海，王华钧，金法祥，陈秋美

【摘要】 目的 ：了解多重耐药肺炎克雷伯菌氨基糖苷类修饰酶基因的存在状况。方法 ：自2006年1月至2006年10月住院病人标本中分离并筛选出20株多重耐药肺炎克雷伯菌，微量肉汤稀释法检测20种抗菌药物的敏感性;PCR法检测15种氨基糖苷类修饰酶基因。结果：20株多重耐药肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类药物庆大霉素、妥布霉素、奈替米星及阿米卡星耐药率分别为75%、80%、65%和60%，其中氨基糖苷类修饰酶aac(3)-Ⅱ基因阳性15株，aac(6’)-Ⅰb基因阳性1株，ant(3”)-Ⅰ基因阳性16株，aph(3’)-Ⅰ基因阳性3株，ant(2”)-Ⅰ基因阳性1株。结论：多重耐药肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类药物耐药的主要原因是aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ib、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ和ant(2”)-Ⅰ等5种氨基糖苷类修饰酶基因的存在;从肺炎克雷伯菌中检出aac(6’)-Ib-Cr型和aph(3’)-Ⅰ均为国内首次。

【关键词】 肺炎克雷伯菌;氨基糖苷类修饰酶;多重耐药性

Abstract: Objective: To understand the existence of genes encoding aminoglycoside modifying enzyme in multi-resistant Klebsiella pneumoniae. Methods: Samples of 20 strains of multi-resistant Klebsiella pneumoniae collected from the patients from January 2006 to October 2006 were isolated and screened out. The sensitivity of 20 antibacterial agents by means of broth induction was detected， and genes of aminoglycoside modifying enzyme by way of polymerase chain reaction were detected. Results: The resistance rates of 20 strains of multi-resistant Klebsiella pneumoniae to aminoglycoside，such as gentamicin，tobramycin，netilmicin and amikacin were 75%，80%，65% and 60%，respectively. Of which， 15 strains of aminoglycoside modifying enzyme aac (3’)-Ⅱ gene positive， 1 strain of aac (6’)-Ib，16 ones of ant (3”)-Ⅰ，3 ones of aph (3’)-Ⅰ and 1 strain of ant (2”) were found at the same time. Conculsion: The main reasons of multi-resistant Klebsiella pneumoniae resistance to aminoglycoside are the presence of aminoglycoside modifying enzymes called aac (3)-Ⅱ， aac (6”)-Ib， ant (3”)-Ⅰ， aph (3’)-Ⅰ and ant (2”)-Ⅰgenes. Genes of aac (6’)-Ib-Cr and aph (3’)-Ⅰ in Klebsiella pneumoniae are both first found and reported in China.

Key words: Klebsiella pneumoniae;aminoglycoside modifying enzyme;multidrug resistance

肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae，KPN)已是医院感染的重要病原菌。近年尽管国内已有KPN菌的氨基糖苷类药物部分耐药相关基因研究报道[1-2]，但报道所涉及耐药相关基因较少。我们曾报道了一组老年患者KPN菌分离株β-内酰胺酶基因分型研究[3]，为进一步了解我院多重耐药KPN菌氨基糖苷类药物各种耐药相关基因存在状况，我们对20株分离自老年病房产β-内酰胺酶的KPN菌进行了15种氨基糖苷类修饰酶基因检测，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 菌株来源及鉴定 20株均为分离自2006年1月-2006年10月间我院老年病房患者(年龄61～90岁)临床标本，分别为：痰液13份，尿液6份，胆汁1份。全部菌株均使用ATB细菌鉴定仪鉴定菌种。

1.2 抗菌药物敏感性试验 药敏试验按美国CLSI 2006年版要求。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心，抗菌药物敏感试验采用微量肉汤稀释法。

1.3 细菌处理 挑纯培养菌落置入0.5 mL离心管内(内预置200 ng/mL蛋白酶K溶液200μL)，56℃水浴2 h，改95 ℃水浴10 min，离心(15 000 r/min)30 s。上清液即为基因检测的模板液，-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 基因PCR检测 15种氨基糖苷类修饰酶基因检测均为PCR法，靶基因引物序列和目的产物长度见表1。各种靶基因PCR扩增体系均为:每反应体系P1引物1μL(1.0μmmol/L)、P2引物1μL(1.0μmmol/L)，dNTPs 2μL(2 mmol/L)，10倍缓冲液2μL(KCl 10 mmol/L，(NH4)2SO4 8 mmol/L，MgCl2 2 mmol/L，Tris-HCl(pH 9.0)10 mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(wt/vol))，Taq DNA pol 1 U(不计体积)，超纯水9μL， 模板液5μL，总反应体积20μL。PCR扩增热循环参数为：93 ℃预变性2 min，然后93 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，循环35周期，最后一个72 ℃延长至5 min。PCR产物长度>500 bp者PCR扩增热循环参数为：93 ℃预变性2 min，然后93 ℃ 60 s→55 ℃ 60 s→72 ℃ 60 s，循环35周期，最后一个72 ℃延长至5 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。检测试剂盒和阳性对照DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

1.5 基因测序 PCR阳性产物为PCR直接全自动荧光法测序，委托上海博尚生物技术有限公司完成(测序在美国ABI公司3730型毛细管全自动测序仪上进行)。读序工具软件为Chromas，测序结果作BLASTn(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn)比对。

2 结果

2.1 抗菌药物敏感性试验 药敏结果见表2。20株产β-内酰胺酶KPN菌对氨基糖苷类药物庆大霉素、妥布霉素、奈替米星及阿米卡星耐药率分别为75%、80%、65%和60%，表明可能存在多种氨基糖苷类修饰酶，使细菌耐受氨基糖苷类抗菌药物;另外，对常见头孢类抗生素，如头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟等全部耐药，对亚胺培南敏感，验证了超产β-内酰胺酶的前期结果，同时表明所有细菌都同时存在β-内酰胺类及其氨基糖苷类抗生素耐药酶。

2.2 基因PCR检测及其测序 20株KPN菌15种氨基糖苷类修饰酶基因检测结果见表3。其中各抽取1株aac(6’)-I b、ant(2”)-I、aph(3’)-I PCR阳性产物进行测序，经BLASTn比对分别为aac(6’)-I b-Cr、ant(2”)-I、aph(3’)-I。其中，国内首次在KPN菌中发现的aac(6’)-I b-Cr、ant(2”)-I基因序列见图1、2。

3 讨论

氨基糖苷类抗菌药物自1944年首次发现链霉素以来，一直是临床上重要的抗感染药物，因此类药物抗菌谱广、疗效卓越，在临床和畜牧兽医业得到广泛应用。但由于滥用和过度使用，耐药问题随之凸现，细菌对该类药物有多种耐药机制：通过产氨基糖苷类修饰酶(AME)、细菌16SrDNA基因甲基化酶(编码基因为rmtA)和氨基糖苷类药物作用靶位16SrDNA基因(16SrDNA)突变而致，其中前者为主要原因，氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、核苷转移酶(ANT)和磷酸转移酶(APH)3类，目前已发现的有30余种。氨基糖苷类修饰酶是基因转移酶，这些酶共价修饰抗菌药物导致其结构变化，从而丧失与靶点的结合能力。国内有关革兰阴性细菌，如鲍氏不动杆菌与铜绿假单胞菌氨基糖苷类药物各种耐药相关基因报道较多[4-5]，KPN菌氨基糖苷类药物各种耐药相关基因报道极少、所涉及耐药相关基因较少[1-3]。

本研究20株分离自老年病房产β-内酰胺酶的KPN菌中有aac(3)-II、aac(6’)-I b、ant(3”)-I、aph(3’)-I、ant(2”)”I 5种基因阳性，氨基糖苷类药物耐药表型与基因型基本相符。2006年，美国学者Robicsek等[6]发现了不仅对氨基糖苷类药物有修饰作用，而且对喹诺酮类药物也有修饰作用的新氨基糖苷类修饰酶——aac(6’)-I b”Cr型。2007年国内学者从阴沟肠杆菌和大肠埃希菌中也查出aac(6’)-I b-Cr型[7-9]。本研究从产β-内酰胺酶的KPN菌中查出aac(6’)-I b-Cr型和aph(3’)-I基因均为国内首次。国内另有学者从KPN菌、大肠埃希菌中查出aac(6’)-I b基因家族新亚型[10-11]，我们将进一步积累菌株数完成流行病学研究。