关于用考马斯亮蓝测定动物药材中可溶性蛋白质含量方法初探

【摘要】 目的 探讨考马斯亮蓝法用于测定动物药材中可溶性蛋白质含量的稳定性研究。方法 采用紫外分光光度法，以蟾蜍干体为原料，牛血清白蛋白为对照，在595 nm处测定蛋白质与考马斯亮蓝结合复合物的吸光值。结果 实验表明，吸光度和蛋白含量间具有良好的线性关系(r=0.996)，样品在10 min内测定稳定(RSD=5.0%)。结论 本方法可靠、简单、快速。

【关键词】 考马斯亮蓝；动物药材；可溶性蛋白质；含量测定

Abstract: Objective To study the stability of the Bradford method for determination of soluble protein in animal materials. Method The absorption of CBB G-250 combined with proteins was determined by the UV-Spectrophotometry method with the detection wavelength at 595 nm， and the dried bufo was selected as sample， BSA as control. Results The method showed a good linear relationship between absorption and protein content (r=0.996). The sample was stable with in 10 min (RSD=5.0%). Conclusion This method was reliable， simple and rapid.

Key words：CBB；Animal material；soluble protein；content measuring 考马斯亮蓝法是Bradford 1976年建立起来的测定蛋白质含量的方法，这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。此方法的原理是基于：考马斯亮蓝G-250是一种蛋白质染料，最大吸收峰在465 nm，在酸性溶液中它与蛋白质通过范德瓦尔引力结合形成考马斯亮蓝G-250-蛋白质复合物时，其最大吸收峰改变为595 nm，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可用于蛋白质含量的测定。本实验室应用此方法初步建立了动物药材可溶性蛋白质含量测定标准，从而进行了如下相关实验的研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 牛血清白蛋白(BSA)：北京鼎国生物技术有限责任公司。Genview分装考马斯亮蓝G-250：Ultra pure上海生物工程有限公司；盐酸：分析纯，北京世纪红星化工有限责任公司；无水乙醇：分析纯，北京北化精细化学品有限责任公司；0.9%盐水，同领(大同)药业有限公司；UV-2401 PC，SHIMADZU；GL-88B漩涡混合器，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 溶液的配制 考马斯亮蓝G-250溶液配制：称取20 mg考马斯亮蓝G-250溶于20 mL 95%的乙醇中，另取36%盐酸3 mL和113 mL盐水混匀，再与考马斯亮蓝乙醇液混合并定容至200 mL，用前0.45 μm过滤。1 mg/mL BSA溶液配制：称取10 mg BSA冻干粉溶于蒸馏水中并定容至10 mL。

1.3 BSA与考马斯亮蓝G-250结合后溶液光吸收值的稳定性

分别取100 μL BSA含量为314.75 μg/mL、630 ng/mL、2.5 ng/mL标准溶液，各加入3 mL考马斯亮蓝溶液，于595 nm分别在5、10、20 min 测定。

1.4 BSA线性关系考察 取BSA标准630、315、157、79、40、20、10、5、2.5 ng/mL各100 μL加入3 mL考马斯亮蓝G-250溶液中，涡旋混匀，分别于5、30 min在595 nm处测定。

1.5 动物药材水提液可溶性蛋白质线性关系考察

1.5.1 动物药材可溶性蛋白质提取液的制备

将蟾蜍干药材粉碎，过80目筛，取40 g用80 mL蒸馏水润湿并搅匀，于4 ℃冰箱静置48 h，4 ℃、9 000 r/min离心40 min，取上清，0.45 μm过滤即得原液。

1.5.2 动物药材水提液可溶性蛋白质线性关系

将原液用蒸馏水10倍稀释，并将稀释液依次10倍稀释，各取100 μL加入3 mL CBB液中，涡旋混匀，595 nm测定，得到样品最低定量限，并初步确定待测的浓度范围。将所需的浓度样品做倍比稀释，最高浓度标记为64，依次稀释为32、16、8、4、2、1，各取100 μL加入3 mL CBB液中，涡旋混匀，595 nm测定。

2 结果

2.1 BSA与考马斯亮蓝G-250结合后溶液吸光值稳定性测定结果

(见表1)表1 BSA与考马斯亮蓝G-250结合后溶液吸光值稳定性研究（略）注：表中每个光密度值是3次试验的平均值。

由表1可看出：溶液光密度值随着时间变化而变化，浓度较高时呈负吸收，复合物吸光值在10 min内RSD较小，溶液较稳定，浓度太高或太低稳定性都较差，所以寻找适当的蛋白质浓度，并且在10 min内测定很重要。 2.2 BSA浓度对吸光度的线性关系

5 min时在400～800 nm对标准蛋白复合物全波长扫描，当浓度为5.0 ng/mL的S/N=3，5.0 ng/mL可作为最低检测限，实验表明：40 ng/mL作为最低定量限，由图1可看出5～40 μg/mL不呈线性，在40～630 ng/mL线性较好，说明蛋白质浓度较低时有线性关系，但浓度太低时不存在线性。

5 min时测得的R=0.996，在30 min时测定标准蛋白复合物线性关系时R=0.941，由相对标准偏差可知，复合物随着时间变化线性关系变差(见图2、图3)。 2.3 动物药材粗提液可溶性蛋白质的线性关系

试验过程中在原液108稀释时得到复合物最低检测限，将 106倍稀释液作为基础倍比稀释，在10 min内测定线性关系较好(见图4)。

3 讨论 虽然Bradford法有不少优点，但由于受到影响的因素较多，优化出一套较好的实验条件并不容易。Marcelo等[1]对此法的机制进行了深入的研究，认为pH值、时间、温度是本方法的重要变量。由于温度的影响具体操作有困难，本实验未对温度进行研究。对时间的考察本实验认为在复合物形成后的10 min内测定比较好。 实验中所用标准蛋白与样品均用蒸馏水溶解，已有研究证明不同溶剂光吸收的差异对蛋白质的测定结果无影响[2]。而且本实验蛋白溶液和考马斯亮蓝溶液体积比为1∶30，溶剂对光吸收的影响更小。 H+浓度是影响标准曲线线性关系的主要因素，适当控制显色液中的H+浓度使显色前后H+浓度保持恒定非常重要。有文献用磷酸配缓冲液，但酸浓度不好控制，酸浓度降低灵敏度增大，但酸浓度低到一定程度后灵敏度下降，线性关系随酸浓度的降低明显的变差，酸浓度高线性关系较好但灵敏度低，增加蛋白浓度易出现复合物沉淀。本实验采用了郭氏提供的显色液配方[3]，即使用的HCl-NaCl缓冲液溶解考马斯亮蓝G-250，而且线性关系的确不错。

【参考文献】 [1] MAO Silva， MAZ Arruda. Mechanization of the Bradford reaction for the spectrophotometric determination of total proteins. Anal[J].Biochem，2006，(351)：155－157. [2] 曲春香，沈颂东，王雪峰.用考马斯亮蓝测定植物粗提液中可溶性蛋白质含量方法的研究[J].苏州大学学报(自然科学版)，2006，22(6)：82－85. [3] 郭敏亮，姜永明.考马斯亮蓝线色液组分对蛋白质测定的影响[J].生物化学与生物物理进展，1996，23(6)：558－561.