丹参药材水溶性成分含量的HPLC法浅析

作者：李曼玲，冯伟红，康 琛，梁日欣，杨洪军，何希荣，黄璐琦

【摘要】 目的 建立丹参药材水溶性成分中丹酚酸B、丹参素和原儿茶醛的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法测定，色谱柱为Kromosil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相Ⅰ：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)，流动相Ⅱ：甲醇-冰醋酸-水(20∶1∶80)；流速：1.0 mL/min；检测波长分别为286、280 nm；柱温35 ℃。结果 测定了10个不同产地的丹参药材，丹酚酸B含量在0.09%～6.81%之间，平均回收率为99.64%，RSD＝1.09%；丹参素的含量在0.16%～0.68%之间，平均回收率为98.94%，RSD＝1.49%；原儿茶醛的含量在0.01%～0.09%之间，平均回收率为98.96%， RSD＝1.66%。结论 本法简便、准确、重复性好，可作为丹参药材的含量测定标准。

【关键词】 丹参；丹酚酸B；丹参素；原儿茶醛；高效液相色谱法

Key words：Salvia miltiorrhiza Bge.；Salvianolic acid B；Danshensu；Protocatechuic aldehyde；HPLC

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，味苦，性微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的作用。用于月经不调，经闭通经，癥瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心绞痛等。丹参的主要药效成分之一是丹参中的水溶性成分，主要是酚酸类化合物丹酚酸B、丹参素和原儿茶醛。我们采用HPLC法建立了这3种成分的含量测定方法，可用于丹参及其饮片和制剂的研究及质量控制等。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪：HP1100高效液相色谱仪，G1315A DAD检测器，G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1316A柱温箱，G1322A在线脱气机，Agilent ChemStation色谱工作站。丹酚酸B对照品(批号200201)、丹参素钠对照品(批号855-200102)、原儿茶醛对照品(批号0801-9402)均为供含量测定用，购于中国药品生物制品检定所。乙腈：色谱纯，美国；甲醇：色谱纯，北京化工厂；高纯水：自制；其他试剂均为分析纯。丹参药材由本所生药室提供。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸B的含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长λs＝286 nm；理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于4 000。在此条件下丹酚酸 B与其他组分达到良好分离(见图1)。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过3号筛)0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，取出，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备

取丹酚酸B对照品适量，加75%甲醇溶解并制成每1 mL含0.14 mg的溶液，即得。

2.1.4 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品溶液(0.14 mg/mL) 4、8、12、16、20 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以丹酚酸B的进样量为横坐标，以峰面积的积分值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程：Y＝-0.153 6＋895.6X，r＝0.999 6，结果表明，丹酚酸B在0.56～2.8 μg范围内呈线性关系。

2.1.5 精密度试验

取供试品溶液1份，在上述色谱条件下连续进样5次，每次进样5 μL，测定丹酚酸B含量，经计算，RSD＝0.28%。

2.1.6 重复性试验

平行制备5份供试品溶液，分别在上述同一色谱条件下，分别进样5 μL，测定丹酚酸B含量，经计算， RSD＝2.24%。

2.1.7 稳定性试验 取供试品溶液1份，上述色谱条件下，分别于样品制备后第0、1、2、4、8、16、24 h进行测定，测定丹酚酸B含量，经计算，RSD＝1.76%。

2.1.8 加样回收率试验

取已知含量的丹参药材粉末，分别加入等量的丹酚酸B对照品，按上述色谱条件测定，计算回收率，丹酚酸B为99.64%，RSD＝1.09%。见表1。表1 丹酚酸B回收率试验结果（略） 2.1.9 含量测定

按供试品溶液制备方法，分别对10个不同来源丹参药材丹酚酸B的含量进行测定。结果见表2。表2 不同产地丹参药材丹酚酸B的含量测定结果（略）

2.2 丹参素和原儿茶醛的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-冰醋酸-水(20∶1∶80)；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长λs＝280 nm。理论板数按丹参素峰计算应不低于4 000。在此条件下，丹参素、原儿茶醛与其他组分达到良好分离(见图2)。

2.2.2 供试品溶液的制备

取丹参药材粉末(过3号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水25 mL，密塞，称定重量，超声提取1 h，取出，再加热回流4 h，取出，密塞，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备

精密称取丹参素钠、原儿茶醛对照品适量，分别加甲醇溶解，并制成每1 mL分别含丹参素钠0.08 mg(相当于丹参素0.07 mg)、原儿茶醛0.012 mg的溶液，即得。

2.2.4 标准曲线的绘制

分别精密吸取丹参素钠对照品溶液(0.08 mg/mL)和原儿茶醛对照品溶液(0.012 mg/mL)各3、6、9、12、15 μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积。以丹参素钠和原儿茶醛的进样量(μg)为横坐标，以峰面积的积分值为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。丹参素钠Y＝-7.147 2＋406.353X，r＝0.999 1；原儿茶醛Y＝-0.772 7＋ 4 943.475X，r＝0.999 2。结果表明，丹参素钠在0.24～1.2 μg范围内呈线性关系；原儿茶醛在0.036～0.18 μg范围内呈线性关系。

2.2.5 精密度试验

取供试品溶液1份，在上述色谱条件下连续进样5次，每次进样5 μL，测定丹参素、原儿茶醛含量，经计算，丹参素的RSD＝1.26%，原儿茶醛的RSD＝0.86%，二者之和的RSD＝1.13%。

2.2.6 重复性试验

平行制备5份供试品溶液，分别在上述同一色谱条件下，分别进样5 μL，测定丹参素、原儿茶醛含量，经计算，丹参素的RSD＝2.60%，原儿茶醛的RSD＝0.66%，二者之和的RSD＝2.20%。

2.2.7 稳定性试验

取供试品溶液1份，在上述色谱条件下，分别于样品制备后0、1、2、4、8、16、24 h进行测定，测定丹参素、原儿茶醛含量，经计算，丹参素的RSD＝0.58%，原儿茶醛的RSD＝1.47%，二者之和的RSD＝0.58%。

2.2.8 加样回收率试验

取已知含量的丹参药材粉末，分别加入等量的丹参素钠、原儿茶醛对照品，按上述色谱条件测定，二者回收率分别为98.94%和98.96%，RSD分别为1.49%和1.66%(见表3、表4)。表3 丹参素钠回收率试验结果（略）表4 原儿茶醛回收率试验结果（略）

2.2.9 含量测定

按供试品溶液制备方法，分别对10个不同来源丹参药材中的丹参素、原儿茶醛的含量进行测定。结果见表5。表5 不同来源丹参药材中丹参素、原儿茶醛的含量测定结果（略）

3 讨论 在丹酚酸B含量测定中，曾经试用过甲醇-乙腈-甲酸-水不同配比的流动相，结果正文采用的流动相配比分离效果最好，所以最终选择其作为流动相。试验过程中曾对供试品的提取溶媒、溶媒用量、提取方法、提取时间等因素进行了考察，结果表明，正文所列的供试品溶液制备方法为各因素最佳组合。