不同采收期头花蓼药材指纹图谱相似度评价

作者：王祥培，吴红梅，王祥森，刘霞

【摘要】 目的对不同采收期头花蓼药材进行指纹图谱相似度评价，探索最佳采收期。方法用RP-HPLC(DAD)法，梯度洗脱，测定不同采收期头花蓼的指纹图谱，并作相似度比较分析。结果不同采收期头花蓼的指纹图谱有明显差异。结论应注意不同采收季节对头花蓼药材的质量影响。

【关键词】 头花蓼药材; HPLC指纹图谱; 相似度

头花蓼为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Han.ex D.Don的干燥全草或地上部分，具有清热利湿，解毒止痛，活血散瘀以及利尿通淋之功效，主治泌尿系统感染、血尿、湿疹、肾盂肾炎等症[1]。目前测定不同产地、不同采收期头花蓼药材中化学成分的含量已有研究报道[2～5]，但头花蓼化学成分复杂，并且随着采收期的不同存在差异。因此，为了更全面评价头花蓼药材质量和控制质量的稳定性，本文对不同采收期共15批头花蓼药材进行了高效液相指纹图谱研究，并采用国家药典委员会推荐使用的“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)”对不同采收期头花蓼药材的指纹图谱进行相似度评价，并以相似度数据进行系统聚类分析，以期为头花蓼最佳采收期的确定提供参考。

1 材料与仪器

1.1 材料采自西藏墨脱县墨脱镇，共15批，经贵阳中医学院王祥培副教授鉴定为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草。具体见表1。没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0638-9501)，槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：081-90003)，槲皮苷对照品(自制，纯度﹥98%);乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸镏水。

1.2 仪器Agilent1100型高效液相色谱仪(自动进样品)，二极管阵列检测器(DAD);《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》(国家药典委员会)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件采用依利特Hypersil ODS色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，乙腈-0.4%磷酸二元梯度洗脱，体积流量：0.8 ml/min，检测波长：310 nm，柱温25℃。

2.2 流动相条件[6]0～5 min：乙腈 0%～5%，0.4%磷酸 100%～95%;5～55 min：乙腈 5%～25%，0.4%磷酸 95%～75%;55～70 min：25%～30%，0.4%磷酸 75%～70%;70～80 min：乙腈 0%，0.4%磷酸 100%;80～85 min：乙腈 0%，0.4%磷酸 100%。

2.3 供试品溶液的制备[6]取头花蓼细粉(3号筛)2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加100 ml 80%乙醇，置水浴中加热回流2 h，滤过，残渣加100 ml 80%乙醇回流提取1 h，滤过，合并滤液。滤液置蒸发皿中挥干，残渣加80%乙醇定容置10 ml容量瓶中。用微孔滤膜(0.45 μm) 滤过，取续滤液，即得。

2.4 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸、槲皮素和槲皮苷对照品适量，加50%甲醇溶解分别制成0.031 5，0.028 1和0.061 3 mg/ml 的溶液，即得。

2.5 指纹图谱方法学考察[6]

2.5.1 精密度实验取同一份供试品溶液，重复进样6次，测得各共有色谱峰相对留时间及相对峰面积的RSD均低于3%，表明精密度良好。

2.5.2 稳定性实验取同一份供试品溶液，分别在0，2，6，12，20，30 h进行检测，测得各共有色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均低于3%，表明样品溶液在30 h内稳定。

2.5.3 重复性实验取同一采收期的供试品5份，精密称量，按“2.3”项下制备供试品溶液，分别进样，测得各共有色谱峰相对留时间及相对峰面积的RSD均低于3%，表明重复性良好。

2.6 指纹图谱建立 精密吸取对照品与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按选定的色谱条件，进行检测。同一实验条件下，测定所有供试品HPLC色谱图。根据不同采收时间供试品测定结果所给出的峰数、峰值(积分值)和峰位(相对保留时间)等相关参数进行分析、比较，制定优化的指纹图谱，见图1。图1 不同采收期头花蓼药材指纹图谱

2.7 指纹图谱分析[6]

2.7.1 共有指纹峰标定 比较不同采收期头花蓼供试品溶液给出的相关参数，其中13个峰是各批供试品共有，因此确定这13个峰为其共有指纹峰，其中槲皮苷峰较没食子酸峰及槲皮素峰大，选作为参照峰。

2.7.2 头花蓼指纹图谱相似度评价 将15个不同采收期头花蓼样品测定数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，经选峰，设定匹配模板，将峰自动匹配，然后设定标准模板，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出头花蓼HPLC指纹图谱共有模式，与共有模式比较，15批次不同采收期头花蓼药材的相似度结果见表1。

2.8 头花蓼HPLC指纹图谱相似度的分类研究 采用SPSS10.0统计软件对15个样品的指纹图谱相似度数据进行系统聚类分析。结果见图2。从聚类分析结果可以看出，系统将15个样品分为2大组，2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14为一组，其中4，11，3，12，13为一小组，2，7，8，9，10，14为另一小组，1，5，6，15为一组，说明不同采收期头花蓼药材分为2大类，其中以1～4月采收的为一大类，5～12月的为一大类，但9～11月为一小类，5～8月为一小类。表1 不同采收期头花蓼药材相似度结果编号 产地 采收时间 相似度 1 西藏墨脱县墨脱镇 200503 0.351 2西藏墨脱县墨脱镇 200508 0.897 3西藏墨脱县墨脱镇 200509 0.963 4西藏墨脱县墨脱镇 200510 0.954 5西藏墨脱县墨脱镇 200703 0.3716西藏墨脱县墨脱镇 200704 0.4657西藏墨脱县墨脱镇 200705 0.8248西藏墨脱县墨脱镇 200706 0.8519西藏墨脱县墨脱镇 200707 0.89110西藏墨脱县墨脱镇 200708 0.89911西藏墨脱县墨脱镇 200709 0.95512西藏墨脱县墨脱镇 200710 0.96813西藏墨脱县墨脱镇 200711 0.98114西藏墨脱县墨脱镇 200712 0.85215西藏墨脱县墨脱镇 200801 0.6211-2005.03，2-2005.08，3-2005.09，4-2005.10，5-2007.03，6-2007.04，7-2007.05，8-2007.06，9-2007.07，10-2007.0811-2007.09，12-2007.10，13-2007.11，14-2007.12，15-2008.01图2 15批头花蓼HPLC指纹图谱相似度聚类谱系图

3 讨论

本文对西藏墨脱县墨脱镇同一产地的不同采收期头花蓼药材进行指纹图谱相似度及其系统聚类分析，研究结果显示1～4月份采收的头花蓼指纹图谱相似度较低并归为一大类，5～12月份采收的头花蓼指纹图谱相似度较高，归为一大类，其中 9～11月份采收的头花蓼指纹图谱相似度最高，从不同采收期头花蓼药材相似度评价结果和笔者对采收到的药材性状来看，建议头花蓼药材采收应在5～12月份。研究结果与文献报道[5]的基本相符，与 2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中称头花蓼春、夏、秋三季采收有一定的差异。