虫草菌丝药物血清对白细胞介素-1β损伤胰岛细胞的保护作用的实验研究

作者：郑倩 刘红 曹弟勇 刘华 蓝海涛 敬华娥

【摘要】 目的通过白细胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）损伤离体胰岛细胞，研究虫草菌丝( Cordyceps sinensis， CS)含药血清对胰岛细胞的保护作用以及其机制与抗氧化酶和一氧化氮（Nitric oxide ，NO）的关系。方法离体培养乳鼠胰岛细胞，用IL-1β损伤胰岛细胞，与不同浓度CS含药血清共同孵育，应用MTT法检测细胞活性，放免法检测基础和高糖胰岛素分泌量，比色法检测细胞培养上清液中一氧化氮（NO）的含量，诱生型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase ，iNOS）、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione perioxidase，GSH-Px）的活性。结果CS含药血清显著提高IL-1β损伤的胰岛细胞活性，并且胰岛细胞基础和高糖刺激胰岛素分泌量明显提高。IL-1β作用后细胞培养上清液中NOS活性升高，NO含量增加，而SOD，GSH-Px的活性水平降低，经与不同浓度CS含药血清共同孵育后，细胞培养上清液中NO含量减少、iNOS活性降低，SOD，GSH-Px的水平明显升高，呈剂量依赖性，具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结论CS含药血清对IL-1β损伤的胰岛细胞分泌功能和细胞活性有保护作用，其机制与降低iNOS的活性，从而减少NO生成以及提高SOD，GSH-PX的活性水平有关。

【关键词】 虫草菌丝 血清药理学 胰岛 细胞损伤 细胞保护

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of medicated sera of cs on the islet cell damage induced by IL-1β.MethodsThe pancreases of the rats were removed to collect islet cells ，and then the cells were pided into normal control group， IL-1β damadaged group， IL-1β+medicated sera of cs groups.The cellular activity was detected with methyl-thiazol-tetrazolium(MTT) assay，basic amount of insulin secretion and stimulated by high glucose was detected by radioimmunoassay，the content of nitric oxide and activities of nitric oxide synthase superoxide dismutase and glutathione perioxidase were determued according to the kit direction.ResultsMedicated sera of cs obviously improved the islet cellular activity damaged by IL-1β，and basic amount of insulin secretion and stimulated by high glucose were improved（P＜0.01）. content of nitric oxide and activity of nitric oxide synthase in the supernatant were obviously higher in IL-1β damaged group，and there were significant differences between the medicated sera of cs groups and IL-1β damaged group. Compared with IL-1β damage group， medicated sera of cs could significantly elevate the activities of superoxide dismutase and glutathione perioxidase（P＜0.05 ，P＜0.01）.ConclusionMedicated sera of cs plays a protective role in the pancreatic islets damaged by IL-1β.The protective mechanism may be correlated with the decrease of iNOS activity and the content of nitric oxide，and the increase of the activities of superoxide dismutase and glutathione perioxidase.

Key wordsCordyceps sinensis； Seropharmacology； Islets of langerhans； Cytoprotction； Cell trauma 1型糖尿病是一种胰岛β细胞选择性破坏的自身免疫性疾病，其病理表现为大量免疫炎性细胞浸润胰岛，并分泌白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子，其中IL-1β可能是其重要的内源性损伤因子［1］。近年来中草药对糖尿病的防治作用受到了广泛关注。冬虫夏草是一种名贵强壮滋补中药，为麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫上的子座及其幼虫尸体的复合体。其味甘、性温，归肺、肾经，有补虚填精、保肺益肾、止血化痰等作用，现代药理学证明其有抗氧化、调节免疫、抗肿瘤、抑菌、抗病毒的作用。但由于天然虫草有严格的寄生性和特殊的生长地理环境，药缺价高，限制天然虫草的使用。人工虫草是人工发酵培养得到的菌丝，其成分和药理作用与天然虫草基本一致，因此对虫草菌丝的实验研究和临床应用逐步深入，有报道认为虫草菌丝可以降低血糖的浓度［2］，以及提高肝纤维化大鼠的胰岛细胞基础胰岛分泌量［3］，但其具体机制并不清楚，缺乏相关的基础研究。目前有报道认为胰岛抗氧化系统活性降低与一氧化氮（NO）水平提高是糖尿病早期病变之一，NO和氧自由基可破坏胰岛细胞，引起1型糖尿病。本实验室用IL-1β损伤乳鼠胰岛细胞，观察IL-1β对胰岛抗氧化系统活性与NO 水平的影响，采用血清药理的方法探讨虫草菌丝对IL-1β损伤的离体胰岛细胞的活性和分泌功能是否具有保护作用以及其机制与抗氧化作用和NO的关系。

1 器材

1.1 材料出生1~3 d的Wistar大鼠 和体重200～220 g的健康Wistar大鼠均由川北医学院实验动物中心提供；RPMI-1640培养液为美国GIBCO公司产品；IL-1β、胎牛血清为天津灏洋生物科技有限责任公司产品；虫草菌丝购自中美华东医药制药公司(批号061140)；胰岛素放免检测试剂盒为华西生物制剂公司产品；胶原酶V型、STZ均为美国Sigma公司产品；SOD，GSH-Px，NO，NOS 测定盒由南京建成生物工程研究所提供；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器CO2孵育箱（Forma scientific，美国），超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州安泰），倒置相差显微镜（olympus，日本），全自动酶标仪（BIO-RAD，2550型，美国），紫外分光仪（RF-540，日本岛津），台式冷冻高速离心机（日立himac CF-15型，日本），高压蒸气灭菌器（YXQ-SG46，上海博讯有限公司医疗设备厂）。

2 方法

2.1 药物血清的制备 ① 选用Wistar大鼠40只，体重200~220 g，雌雄各半。灌胃前禁食12 h，设立正常对照组和用药组，用药组给予虫草菌丝灌胃，每次10 ml/ kg，分低、中、高3个剂量组（1，10，20 g/kg），分别相当于70 kg成人用量的5，10，20倍，正常对照组给予等容量生理盐水灌胃，所取血清为生理盐水对照血清 ，作对照用。② 使用二次加强给药法给药（首次给药2 h后，再次予相同的剂量灌胃），在第2次给药后第1，2，3 h，于无菌条件下自心脏采血，静置4 h以上，离心30 min(3 000 r/min，4℃)，分离血清，56℃ ，灭活30 min，置-70℃ 低温冰箱冷藏备用，1 个月内使用。

2.2 胰岛细胞分离与培养出生1~3 d的Wistar大鼠20只，无菌取出胰腺，清洗，剪碎，V型胶原酶消化，HankS液终止消化，消化离心。加入10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，制成细胞悬液，37℃，5%CO2孵育箱内培养24 h后，去除成纤维细胞，收集胰岛细胞，制成新的细胞悬液，调节细胞浓度至1×106 ml，置96孔板培养，每孔内加入细胞悬液200 μl。随机分组。分为正常对照组、IL-1β损伤组、IL-1β+不同浓度CS含药血清保护组（IL-Iβ+CS1为低剂量含药血清组，IL-1β+CS2为中剂量含药血清组，IL-1β+CS3为高剂量含药血清组），每组平行孔6孔，损伤组和保护组每孔细胞加100 u/ml IL-Iβ 20 μl作用20 h后，正常对照组加入大鼠生理盐水对照组血清20 μl，于不同保护组分别加入20 μl 低、中和高剂量含药血清CS继续培养30 h，进行各项检测。

2.3 四唑蓝比色法（MTT法）检测细胞活性检测方法如下：将各组细胞离心（500 r/min×5 min），吸取细胞培养上清液，于细胞中加200 μl的培养液（不含胎牛血清）和5mg/ml的MTT 20 μl，放入CO2孵育箱培养4 h后，再离心（1 000 r/min×10 min），弃上清，加入二甲亚枫200 μl，振荡5 min，在全自动酶标仪上比色，测出每孔光密度值（OD值）进行比较，检测波长为600 nm，OD值越高表明细胞活性就越强。

2.4 胰岛细胞上清液胰岛素分泌量测定提取正常对照组、IL-1β损伤组和IL-1β+CS组各待测标本细胞培养上清液，用放免法检测胰岛素的基础分泌量；在抽取上清液的各组细胞中加入含20 mmol/L的葡萄糖培养液继续培养2 h，离心提取上清液，按上述方法进行高糖刺激胰岛素分泌量检测。

2.5 细胞培养液NO水平，iNOS，SOD和GSH-Px活性的检测提取正常对照组、IL-1β损伤组和IL-1β+CS组各待测标本细胞培养上清液，分别用试剂盒进行检测，步骤严格按试剂盒说明进行。

2.6 统计学处理实验结果以±s表示，α=0.05，采用方差分析。整个统计资料采用SAS软件处理完成。

3 结果

3.1 CS药物血清对IL-1β损伤胰岛细胞活性影响表1结果表明IL-1β损伤组与正常对照组比较光密度值OD值降低，表明细胞活性明显下降（P＜0.01）；损伤后加入不同浓度CS药物血清共同孵育可使OD值较损伤组均有不同程度的提高，具有显著意义，且具有剂量依赖性。

表1 不同浓度CS药物血清对IL-1β损伤细胞活性的影响（略）

与空白组比较，﹡﹡P＜0.01；与IL-1β损伤组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6

3.2 细胞培养液胰岛素分泌量测定结果见表2。加入IL-1β作用后胰岛细胞基础分泌胰岛素量和葡萄糖刺激分泌量显著下降（P＜0.01），在损伤的基础上与不同浓度CS药物血清共同培养30 h后，测试培养液中分泌量和葡萄糖刺激胰岛素分泌量较损伤组有明显升高，具有统计学意义。

表2 细胞培养液基础胰岛素分泌量和葡萄糖刺激胰岛素分泌量（略）

与正常对照组比较，﹡﹡P＜0.01; 与IL-1β损伤组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6

3.3 细胞培养液中 SOD，GSH-Px水平的测定与IL-1β作用后胰岛细胞培养液中SOD活性显著降低（P＜0.01），GSH-Px活性减弱（P＜0.01），在损伤的基础上与不同浓度CS药物血清共同培养30 h后，测试培养液中SOD以及GSH-Px的活性升高，具有统计学意义。见表3。

3.4 细胞培养液中NO含量和iNOS活性的检测加入IL-1β后，与正常对照组比较可见胰岛细胞培养液中iNOS的活性与NO含量显著增加（P＜0.01），经与不同浓度CS药物血清共同培养30 h后，测试培养液中iNOS的活性降低，NO 的含量减少，具有统计学意义。见表4。

表3 细胞培养液SOD和GSH-PX活性（略）

与正常对照组比较，﹡﹡P＜0.01；与IL-1β损伤组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01;n=6

表4 细胞培养液NO含量和iNOS活性（略）

与正常对照组比较，﹡﹡P＜0.01；与IL-1β损伤组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；n=6 4 讨论 血清药理学研究是指给动物灌胃或人服用一定量的中药或复方制剂，在一定时间后采集血液，分离血清，以此进行体外试验的一种实验方法。此方法由20世纪中期日本学者Iwama H等提出。与传统的将中药粗提物直接加入反应体系中的方法相比，它具有明显的优势：在某种程度上克服了中药本身的杂质对试验结果的影响，而且相对接近于药物在体内生物转化的真实过程，能客观地阐明中药药效和作用机理，且使中药药理的研究易于深入到细胞分子水平。近20 年来，其已成为中药药理研究的一个热点，在体外实验中得到了广泛的应用，是目前研究中药药理学的一种较为理想的方法［4］。本研究采用血清药理方法探讨CS对IL-1β损伤胰岛细胞的保护作用和机制，实验中多次给药可使血清药物浓度出现累加效应，二次重复给药提高了血清药物浓度，所采集的血清经56℃ ，灭活30 min处理后，避免了未灭活血清中某些物质对细胞产生毒性和不良反应。 本实验表明IL-1β对胰岛细胞具有损伤作用，表现在100 u/ml的IL-1β使胰岛细胞活性减弱，并且可抑制胰岛分泌功能，使胰岛素基础分泌量和葡萄糖刺激胰岛素的分泌量均减少，这与 Ohara-Imaizumi M［5］报道IL-1β可抑制胰岛β细胞活性以及胰岛素释放等生物作用相似。经与含CS含药血清作用后，能反转 IL-1β 损伤的离体胰岛细胞的活性，细胞活性与未加保护剂的损伤组比较均有显著提高；并且能减轻IL-1β 损伤的胰岛素分泌和葡萄糖刺激的胰岛素分泌，使胰岛分泌功能增强。 有报道认为，细胞因子对胰岛细胞的损伤与NO生成增多和SOD，GSH-Px表达异常有关［6］。本实验亦证明IL-1β作用后胰岛细胞SOD，GSH-Px活力明显降低， SOD是机体内清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基（O-2·）保护细胞免受损伤，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。自由基增多可对细胞、组织造成广泛损害，自由基可通过丙二醛等醛类的促交联特点失活蛋白质；可以破坏细胞内一些重要的酶类以及和β细胞膜上的多不饱和脂肪酸反应，降低胞膜流动性，增加通透性，导致线粒体肿胀、DNA断链、降解，直接导致胰岛β细胞损伤。 Robertson RP［7］认为胰岛细胞内抗氧化酶的含量和活性较低，极易受到氧自由基的损害，对抗氧自由基损伤可以提高胰岛细胞的功能，是治疗糖尿病的有效途径之一。 本实验中证实CS含药血清反转IL-1β损伤胰岛细胞SOD，GSH-Px活性，可通过增强抗氧化酶的作用，提高清除体内产生自由基的能力，从而减轻自由基的损伤，保护胰岛细胞。CS其抗氧化作用可能与主要有效成分虫草素有关，虫草素含腺苷、腺嘌呤、尿嘌呤以及18种氨基酸等。 NO可能是IL-1β介导胰岛细胞损伤的另一效应因子，有人认为NO可能是通过降低线粒体内乌头酸酶的活性和抑制电子传递系的功能使细胞内ATP生成减少以及DNA断裂等因素，最终导致胰岛细胞的损伤。体内的NO是L-精氨酸在NOS催化下生成的，现在已经鉴定出胰岛细胞内至少存在两种NO合酶，一种是结构性一氧化氮合酶（cNOS），另一种是有诱生性一氧化氮合酶（iNOS），cNOS释放较低水平的NO，其作用介导不同的生理效应，而在细胞因子介导下，iNOS表达产生大量的NO，导致胰岛细胞的损伤。本实验结果显示，IL-1β组细胞培养上清液中iNOS活性明显升高，正是由于其活性的增强，从而使NO生成量增加，经NO的细胞毒性造成胰岛细胞的损伤。CS含药血清与IL-1β损伤细胞共同孵育后，胰岛细胞培养上清液中iNOS活性降低，NO的生成减少，结果提示CS可通过降低iNOS的活性而抑制NO的生成，减轻NO的毒性作用，从而保护胰岛细胞。 本实验表明CS药物血清对胰岛细胞具有保护作用，其机制与增强SOD和GSH-Px的活性以及降低iNOS的活性，减少NO的生成有关，本研究为寻找1型糖尿病的中药治疗打下了理论基础，同时为1型糖尿病的治疗提供新的思路与临床用药筛选。我国的中医药要走向世界需广大科研工作者对中药药理机制进行全面而深入的研究。由于中药含药血清的制备过程中受到动物选择、给药剂量、采血时间以及含药血清的灭活、除菌、保存等诸多因素的影响，血清中所含的确切药效成分尚未十分明了，其方法在技术上尚需探讨、规范和完善，因此研究CS中药血清对体外胰岛细胞的药理作用还有待多方面验证。 致谢：本院药物研究所张翔老师和袁彬老师给予了极大的支持与帮助，特此致谢！

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