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黄芪注射液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学分析

佚名 2012-10-31

：作者：杨倩春，杨霓芝，陈伯钧，雷娓娓，王桦，马红岩

【关键词】黄芪

摘要：【目的】观察黄芪注射液对大鼠慢性肾炎气虚血瘀证模型的治疗作用。【方法】SD大鼠48只，除12只作空白对照组外，其他大鼠均在慢性肾炎模型的基础上加造气虚血瘀证模型后，随机分为模型组、黄芪高剂量组(8g/kg)和黄芪低剂量组(4g/kg)，每组12只；给药4周后，检测模型大鼠的一般状态、肾功能、细胞免疫功能及肾组织病理学改变，进行组间疗效比较。【结果】黄芪高、低剂量组对模型大鼠的一般状态、生化指标及肾组织的病理损害均有改善作用，并呈现出剂量效应关系。【结论】黄芪注射液能提高慢性肾炎气虚血瘀证大鼠的细胞免疫功能，改善血凝状态，减轻肾组织病理损害，有防治慢性肾炎的作用。

关键词：黄芪注射液/药理学；肾小球肾炎/中药疗法；肾小球肾炎/免疫学；肾小球肾炎/病理学；气虚血瘀；疾病模型，动物；大鼠

应用具有益气作用的黄芪注射液治疗慢性肾小球肾炎病人，临床已取得一定的疗效。在此基础上，我们观察了黄芪注射液对慢性肾炎气虚血瘀证模型的作用，现报告如下。

1 材料与方法

11 动物

健康低龄(3周)雄性SD大鼠(体质量约100g)4只，雄性新西兰兔8只，雄性SD大鼠48只(200～250g)，均由广州中医药大学实验动物中心提供。大鼠合格证号：2002A004；新西兰兔合格证号：2001A067。

12 试剂与仪器

兔抗鼠Thy1抗血清(AST)自备；完全弗氏佐剂由Sigma公司提供；抗兔IgG荧光抗体，由天象人公司提供；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗大鼠IgG由Sigma公司提供；亿鸣-200病理图像分析仪，由广州亿鸣科技有限公司提供。

13 药物

黄芪注射液每10mL含原生药20g，由成都地奥九泓制药厂生产，生产批号：0305061。

14 分组

雄性SD大鼠48只，随机分为4组，每组12只：模型组(A组)、黄芪高剂量组(B组)、黄芪低剂量组(C组)、空白对照组(D组)。

15 大鼠慢性肾炎模型的制备

抗Thy1系膜增殖性肾炎模型的建立参照文献［１］，步骤如下：

151 免疫New Zealand(NZ)白兔

低龄SD雄性大鼠4只，麻醉后取胸腺，剪碎并挤出胸腺细胞，经200目尼龙网过滤除去混杂的组织，滤液为淋巴细胞悬液，以等体积生理盐水和完全弗氏佐剂稀释至1×１０１０／Ｌ，注射至兔背部皮下，每只３×１０７个胸腺细胞；第2、4周时分别静脉注射３×１０７个胸腺细胞，强化免疫。

152 测定抗血清效价

第2次静脉注射胸腺细胞后第3天，从兔耳缘静脉取血2mL，测定血清抗胸腺细胞抗体的效价。方法如下：分离大鼠胸腺细胞，用生理盐水稀释至１×１０１１／Ｌ，取1滴细胞悬液滴于干净玻片，吹干，用体积分数为95%的酒精固定5min，吹干；将正常NZ白兔血清、抗血清原液及其1∶10、1∶20、1∶40、1∶80及1∶160的稀释液各80μL滴加在胸腺细胞涂片上，均匀散开；37℃孵育40min后用磷酸盐缓冲液(PBS)(001mol/L，pH74)冲洗；加抗兔荧光抗体(效价1∶10)，37℃孵育40min，PBS冲洗；当效价大于1∶80(即1∶80的稀释液仍有较强的染色)时将兔放血，离心后，将血清保存于-40℃。

153提纯血清

兔抗血清用饱和硫酸铵法提纯，抗血清(体积设为mL)中加入等体积的PBS(001mol/L，pH 74)及2倍体积的饱和硫酸铵溶液搅拌均匀，在4℃旋转30min后，以6000～9000r/min离心15min，去上清(为白蛋白部分)，沉淀溶于PBS中，再加入2mL饱和硫酸铵溶液，4℃旋转30min，6000～9000r/min离心15min，沉淀继续溶于PBS中，如上重复3次。最后将沉淀溶于少量PBS中，在4℃透析24h，用钠氏试剂检测无铵离子时即得粗制的抗体IgG，经测定蛋白浓度后，于-20℃保存。

154 大鼠抗Thy1抗体肾炎模型的制作

空白对照组尾静脉注射生理盐水20mL/kg；其余各组均于实验当日腹腔麻醉后由尾静脉注射AST 10mL/kg和正常兔血清10mL/kg。

16 大鼠气虚血瘀模型的建立

参考文献［２］方法，在实验第2周时，对各组大鼠行游泳疲劳试验，连续2周。

17 给药剂量及途径

给药剂量

18 观察指标

181 一般状况

观察造模后各组大鼠的精神状态、体质量、体毛、饲料量、大小便及活动情况等。

182 24h尿蛋白定量

分别在第2周末及第4周末用代谢笼分批收集各组大鼠的24h尿液，用磺基水杨酸比浊法进行测定。

183 尿纤维蛋白降解产物(FDP)测定

用乳胶定性法进行测定。

184 血清尿素氮、肌酐测定

采用电极法。

185 淋巴细胞亚群测定

采用T淋巴细胞AMAE复合物染色对比法［３］，计数100个淋巴细胞。

186肾组织学检查

括免疫荧光检查、光学显微镜和电子显微镜观察。

1861 免疫荧光学检查

取小块肾皮质组织作冰冻切片，用FITC标记的兔抗大鼠IgG(效价1∶64)作直接荧光染色，AO onetwenty荧光显微镜观察。荧光强度分级标准参照文献［４］：“-”：未见荧光；“±”：低倍镜下不显现，高倍镜下似乎可见；“+”：低倍镜下似乎可见，高倍镜下可见；“++”：低倍镜下可见，高倍镜下清晰可见；“+++”：低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；“++++”：低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼。

1862光学显微镜观察

取部分肾组织用体积分数为10%的中性甲醛固定，阶梯乙醚脱水，石蜡包埋，切片，苏木素伊红染色(HE)和过碘酸雪夫氏反应染色(PAS)，光学显微镜下进行观察、拍照；每例标本任选10个肾小球，采用病理图像分析仪计算每个肾小球内的系膜细胞数，测量每个肾小球的直径，并作统计分析。

1863 电子显微镜观察

每组3只大鼠分别选取1mm２大小肾组织3块作电镜观察，常规用20g/L戊二醛前固定，10g/L锇酸后固定，阶梯乙醇脱水，环氧树脂EPN 812包埋，超薄切片，并行铀和铅双重染色后，置JEM-1200 EX电子显微镜下观察超微结构。

19 统计学处理

计量资料采用t检验；分类资料采用χ２检验。 2 结果

21 一般情况

在实验过程中模型组有1例大鼠死亡。造模之后各组大鼠均出现不同程度的精神不振、摄食减少、生长迟缓、身体消瘦、蜷缩、体毛无光泽、大便稀烂等现象，尤以模型组最为显著。

22 24h尿蛋白定量测定

结果见表1。表1 黄芪注射液对24h尿蛋白定量的影响（略）

23 血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)测定

结果见表2。表2 黄芪注射液对血清BUN、SCr含量的影响（略）

24 淋巴细胞亚群测定

结果见表3。表3 黄芪注射液对T淋巴细胞亚群的影响（略）

25 尿FDP定性测定

模型组大鼠尿FDP检测全部阳性，阳性率为100%；黄芪高剂量组4例阳性，阳性率333%；黄芪低剂量组5例阳性，阳性率417%；高、低剂量组与模型组比较均有显著性差异(Ｐ＜005)。

26 肾组织学检查

261 免疫荧光检查

结果见表4。表4 黄芪注射液对大鼠肾皮质免疫荧光强度的影响（略）

262 光镜检查

空白对照组肾小球结构正常(图1a)；模型组肾小球增大，肾小球内系膜细胞数增多，可见少量炎性细胞浸润，毛细血管管腔受压，肾小球囊腔狭窄，近曲小管上皮细胞呈轻度或中度水肿(图1b)；黄芪高、低剂量组与模型组比较，系膜细胞增多现象均有减轻，炎性细胞浸润消失，近曲小管上皮细胞内水肿明显好转(图1c、d)。对每例标本任选10个肾小球，采用病理图像分析仪计数每个肾小球内的系膜细胞数，测量每个肾小球的直径，以及从肾小球极到血管极的长度，结果见表5。表5 黄芪注射液对肾小球内细胞数、肾小球大小的影响（略）

263 电镜检查

空白对照组细胞结构完整(图2a，图3a)；模型组系膜细胞增多，系膜区基质增生，系膜区增宽，有云雾状致密物在系膜区沉积，基底膜稍增厚，毛细血管管腔轻、中度变窄，毛细血管内皮细胞轻度或中度肿胀(图2b，图3b)；黄芪高剂量组与模型组比较，系膜细胞增生情况减轻，基底膜恢复正常，系膜区增宽情况减轻，足细胞的足突未融合，毛细血管管腔病变情况消除，毛细血管内皮细胞无肿胀(图2c，图3c)；黄芪低剂量组与模型组比较，病理改变均轻于模型组，但重于黄芪高剂量组(图2d，图3d)。

3 讨论

31 模型的选择、制备及评价

根据国内1 397例慢性肾衰的资料分析，在引起终末期肾衰的各种病因中，慢性肾炎占首位，达6419%［５］。而系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是我国原发性肾小球疾病中最常见的病理类型，据统计约占我国肾穿刺病人的50%左右［６］。1997年世界卫生组织(WHO)肾病委员会正式把MsPGN作为肾小球肾炎中一个独立类型，以持续性蛋白尿和血尿为特征，它的主要病理变化是肾小球系膜细胞增殖和细胞基质增多，可导致肾小球纤维化和肾小球硬化［７］。

慢性肾炎属于中医学的“水肿”、“腰痛”等范畴，后期可属“虚劳”范畴，其发病多为本虚标实。慢性肾炎病程长，久病不愈，导致正气虚弱，其中以肺、脾、肾三脏亏虚为主。肺主一身正气；脾为后天之本、气血生化之源，主运化；肾为先天之本，主水液。肺虚不能通调水道，水液内停；脾虚则运化失司，湿浊内生；肾虚则气化功能失常，内生水湿，均导致气血运行不畅，血行迟滞而成瘀；气为血帅，气行则血行，气虚无力推动血液运行，阻滞而成瘀。有研究认为气虚血行不畅导致瘀血，虚与瘀均贯穿疾病的始终［８］，慢性肾炎的发病过程中气虚血瘀型所占比例约563%［９］。

本实验选择陈氏Thy1大鼠肾炎模型，其特点是：①该模型接近人体慢性肾炎病变；②采用抗胸腺细胞血清法诱发大鼠系膜增殖性肾炎，方法简单，模型成功率高，可达100%［７］。该模型病变明显，且能较长时间持续存在，首次注射Thy1抗血清后，每周1次，连续4次［１０］，模型在实验周期内更加稳定。我们在大鼠肾炎造模过程中，进行了大鼠游泳疲劳试验，复制出慢性肾炎气虚血瘀证模型，因此本实验的动物模型既具有中医肾“病”的特征，同时又具有中医“证”的特征。造模过程中大鼠出现了精神不振，摄食减少，生长迟缓，身体消瘦等症状，与气虚症状相吻合。T淋巴细胞亚群检测提示模型组大鼠CD３、CD４降低，CD８增高，导致CD４与CD８比值降低，表明机体存在细胞免疫功能紊乱；造模大鼠出现尿纤维蛋白降解产物增多，表明本实验大鼠慢性肾炎气虚血瘀证模型造模成功。

32 黄芪的作用机理

黄芪注射液是从中药黄芪中提取而成，富含多种氨基酸和微量元素等，有益气健脾、利水消肿的作用［１１］。动物实验表明其具有扩张血管，降低血压，抗血小板凝集，增加肾血流量，改善肾脏微循环和消除过氧化脂质作用［１２］。黄芪还能抗氧化自由基，降低自由基生长，促进自由基消除，从而保护肾组织细胞［１３］。

本研究结果表明，黄芪能降低24h尿蛋白含量，降低血清BUN、SCr的水平，并呈现良好的剂量效应关系；能提高细胞免疫功能，降低尿FDP水平。黄芪高、低剂量组与模型组比较，系膜细胞增生现象均有减轻，炎性细胞浸润消失，近曲小管上皮细胞内水肿明显好转；基底膜恢复正常，系膜区未见增宽，毛细血管腔受压情况消除，内皮细胞肿胀情况减轻。本研究提示：黄芪注射液能减少尿蛋白、改善肾功能、提高细胞免疫功能、降低尿FDP，减轻肾组织病理改变，从而达到防治慢性肾炎的目的。

参考文献：

［１］陈广平．大鼠Thy1抗血清制备及系膜增殖性肾炎模型建立［Ｊ］．临床与实验病理杂志，1996，12(3)：12．

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［３］Quesada.T淋巴细胞AMAE染色的复合物对比染色法［Ｊ］．中华医学检验杂志，1983，6(4)：234．

［４］陈莉芬，李荣亨，曹文富，等．黄芪对慢性肾炎患者血及尿IL6影响的研究［Ｊ］．中国西医结合">中西医结合肾病杂志，2002，3(1)：39．

［５］全世建．中医药治疗常见系膜增殖性肾炎进展［Ｊ］．江西中医药，1999，30(1)：56．

［６］刘静芳，温进坤，严霞．抗胸腺细胞血清法诱发大鼠系膜增殖性肾炎模型［Ｊ］．中国病理生理杂志，1999，15(3)：277．

［７］陈广平，郭慕依，张月娥．大鼠抗Thy1血清制备及系膜增殖性肾炎模型的建立［Ｊ］．临床与实验病理学杂志，1996，12(3)：241．

［８］李治平，胡金明．丹参在脑血管病中的运用及药理作用研究概况［Ｊ］．新中医，1994(6)：63．

［９］包，杨霓芝．慢性肾小球肾炎气虚证及其兼夹证分析［Ｊ］．江苏中医，2000，21(5)：10．

［１０］杨霓芝，包，王立新，等．通脉口服液对慢性肾炎气虚血瘀证大鼠模型的药效学影响［Ｊ］．广州中医药大学学报，2001，18(3)：32．

［１１］郭晓燕．慢性肾小球肾炎治疗近况［Ｊ］．内蒙古中医药，1992(2)：39．