关于恶性脑胶质瘤烷化剂耐药机制及其调节

【摘要】 烷化剂是用于治疗恶性脑肿瘤的主要药物，通过破坏DNA并诱导细胞凋亡对肿瘤细胞进行杀伤作用。内在性或获得性的烷化剂耐药是恶性脑肿瘤患者治疗失败的主要原因。烷化剂治疗脑肿瘤受多种途径调节影响：包括DNA修复途径、碱基切除修复(BER)途径等，对其影响途径的研究有助于克服烷化剂耐药，同时采用临床前模型试验有助于制订有效治疗方案克服耐药及促进药物开发。 【关键词】 胶质瘤;烷化剂;耐药;临床前期模型试验 烷化剂是用于治疗恶性脑肿瘤的主要药物，通过破坏DNA并诱导细胞凋亡对肿瘤细胞起杀伤作用。烷化剂包括卡莫司汀(亚硝基脲)、洛莫司汀(氯乙基亚硝基脲类)和替莫唑胺，容易穿过血-脑屏障作用于恶性胶质瘤。尽管这些药物在大脑中可以达到有效治疗浓度，但恶性胶质瘤常常发生耐药。内在性或获得性的烷化剂耐药是恶性脑肿瘤患者治疗失败的主要原因。认识肿瘤的多种耐药机制，制定有效的治疗方案克服耐药是临床前期研究和临床研究的焦点。烷化剂治疗脑肿瘤受多种途径调节影响：包括DNA修复途径、碱基切除修复(BER)途径等，对其影响途径的研究有助于克服烷化剂耐药，同时采用临床前模型试验有助于制订有效治疗方案克服耐药及促进药物开发。本文对恶性脑胶质瘤烷化剂耐药机制及调节的研究进行综述。 1耐药机制 1.1O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)烷化剂的作用机制主要是攻击细胞DNA，造成肿瘤细胞DNA烷基化损伤(包括甲基化、氯乙基化等)，进而形成DNA交联，导致细胞死亡。烷化剂产生的烷基化损伤有12种，其中DNA中O6-甲基鸟嘌呤的烷基化损伤对细胞危害最大，其造成碱基错误配对，即G：C→A：T，进而形成链交联和链断裂，最终导致肿瘤细胞死亡。MGMT是一种普遍存在的DNA修复酶，主要通过不可逆地将烷化基团从O6-甲基鸟嘌呤转移到自身蛋白，修复鸟嘌呤，使烷化剂耐药。在人类肿瘤中，MGMT基因一般不通过突变失活，MGMT的功能丧失最常见的是由启动子区域甲基化造成[1-2]。临床前期研究表明，MGMT基因启动子离散区域甲基化造成该基因的遗传沉默、MGMT表达的失活，从而减少DNA修复。MGMT基因启动子甲基化的肿瘤对烷化剂更加敏感，而MGMT启动子未甲基化的肿瘤表达高水平酶活性，更耐烷化剂[3]。因此，通过对MGMT基因启动子甲基化的检测可预测烷化剂对脑肿瘤的耐药情况[4]。临床上检测MGMT基因启动子甲基化能够指导肿瘤个体化治疗及预见性化疗。最近研究表明，在脑胶质瘤中，MGMT基因启动子区CpG岛甲基化发生率达到46%，启动子区CpG岛甲基化状态与MGMT蛋白表达密切相关[4]。 1.2DNA错配修复(MMR)途径MMR途径在调节O6-甲基鸟嘌呤的毒性杀伤作用中至关重要。人类的错配修复基因主要有hMLH1、mutS homolog 2 (homosapiens， hMSH2)、mutS homolog 6 (homosapiens，hMSH6)、mutS homolog 3 (homosapiens，hMSH3)、postmeiotic segregation increased 1 (homosapiens，hPMS1)等。MMR途径出现在DNA复制过程中，能特异性识别、切除并修复错配碱基，以保证遗传物质的稳定性和完整性。MMR系统中基因失活引起替莫唑胺耐药，可能是因为细胞变得能够耐受胸腺嘧啶与O6-甲基鸟嘌呤的错配。在DNA复制的过程中，DNA聚合酶使O6-甲基鸟嘌呤与胸腺嘧啶错配，从而触发MMR依赖清除错配的胸腺嘧啶。然而，O6-甲基鸟嘌呤依然存在，随后O6-甲基鸟嘌呤与另外一个胸腺嘧啶错配导致反复的MMR途径的循环。有人认为，这是MMR系统徒劳的循环诱导双链断裂，激活凋亡途径，诱导细胞调亡。因此，MMR缺乏的肿瘤对烷化剂如替莫唑胺的细胞毒性作用相对耐药。同时，MMR基因失活将会引起DNA复制错误(RER)和微卫星不稳定性(MsI)，使整个基因组的不稳定性增加，从而导致癌相关基因突变不能及时有效纠正，使肿瘤易感。Cahill等[5]在体外研究中发现经同步放化疗以及单纯替莫唑胺化疗复发的胶质瘤中都有hMSH6的缺失。 1.3BER途径烷化剂耐药的另一种重要机制是BER途径，包括N7-甲基鸟嘌呤和N3-甲基腺嘌呤 DNA复合物的修复。该DNA复合物是由替莫唑胺作用而产生。多聚ADP-核糖聚合酶(PARP-1)在BER途径中起着关键作用。这种酶被DNA链断裂激活，并在大多数人类细胞系中高水平表达，这促使将PARP抑制剂作为增强替莫唑胺的细胞毒性的方法进行了研究。抑制BER途径期盼将增加N7甲基鸟嘌呤和N3甲基腺嘌呤损伤的细胞毒性(在正常细胞和具有完整的BER途径的肿瘤细胞很容易修复)，特别是PARP抑制剂预计将大幅提高替莫唑胺在MMR缺陷细胞中的细胞毒性，使得细胞耐受O6-甲基鸟嘌呤DNA复合物[6]。 1.4细胞凋亡调节基因除了包括DNA修复在内的上述耐药机制，脑胶质瘤的耐药可能受到细胞凋亡调节基因和蛋白质调节异常的影响。例如，失去p53的正常功能， Bcl-2或Bcl-XL的上调，或者表皮生长因子受体(EGFR)的过度表达等，可能会破坏DNA损伤的正常凋亡反应。众所周知， p53基因在保护DNA损伤方面和调节间接凋亡的信号途径上起核心作用。Trp53(在小鼠中编码p53基因)缺陷的小鼠肿瘤和Trp53突变的细胞系对伽马刀或化疗不太敏感。通过腺病毒载体重新引入野生型Trp53的小鼠肿瘤能够恢复对药物毒性的敏感性，在裸鼠体内引起凋亡和抑制肿瘤生长。野生型p53与包括EGFR、 MDM2和Bcl-2在内的多种基因的启动子相互作用，其增加了EGFR和MDM2基因的转录活性，抑制了Bcl-2的转录。在Sarkaria等[7]对于患者肿瘤组织样本的分析中，p53的失活发生在>50%的原发神经胶质母细胞瘤，这与Bcl-2的上调相关。与这些研究结果一致，在体外神经胶质瘤细胞系中，Bcl-2或EGFR表达的上调与耐药和降低凋亡反应有关。 EGFR是在恶性胶质瘤中最频繁扩增和突变的癌基因，一些临床及病理组织学的研究表明，EGFR的扩增可能影响恶性胶质瘤的化疗疗效。在野生型p53基因表达的人胶质瘤的一项研究中，EGFR的肿瘤源性的突变形式称作变异Ⅲ(EGFRv Ⅲ)，其过度表达导致对顺铂耐药，但这种突变尚不能确定对烷化剂特异性耐药。 虽然在胶质母细胞瘤中EGFR、MDM2和Bcl-2表达的失调经常会发生，但无论是对于胶质瘤的生物学行为还是患者的生存，基因表达中这些变化现在还没有一个可明确作为独立的预测因素。为了克服多形性胶质瘤表型的耐药，更多研究针对细胞调节凋亡机制和DNA损伤的敏感性。烷化剂替莫唑胺的活性可能与MGMT的活性密切相关。一项研究揭示了人恶性胶质瘤细胞系中MGMT、Bcl-XL及p53对调节烷化剂细胞毒性的作用。这项研究表明， Bcl-XL蛋白在MGMT阴性的LNT229细胞中减弱替莫唑胺的毒性作用，但在MGMT阳性LN-18细胞中没有减弱替莫唑胺的毒性作用。野生型p53功能的丧失、RNA干扰或一种显性失活p53的突变体同样赋予替莫唑胺耐药。相反，稳定的p53野生型构象如cp-31398使胶质瘤对替莫唑胺敏感[8]。此外，由于低级别胶质瘤中p53突变发生率高，他们可能对替莫唑胺不太敏感。然而，这些结论受临床前应用模式限制，可能不能准确反映临床表现。 2临床前期模型实验对克服耐药的作用 理想情况下，临床前期模型实验将有利于获得最佳治疗方案，从而使最有效的治疗方案进入临床试验。这些模型系统可作为治疗反应的预测指标，指导新治疗因子及治疗方法，从而最大限度地减少患者接受无效的治疗方法。其中的动物模型在研究肿瘤发病机制、模拟肿瘤发生过程、测试肿瘤治疗方法中起重要的作用[9-10]。 2.1细胞培养模型目前有几种细胞培养模型已用来检测MGMT在替莫唑胺耐药方面的作用。例如，缺乏内源性MGMT表达的中国仓鼠卵巢细胞研究表明，MGMT的过度表达导致替莫唑胺耐药[11]。同样，建立胶质瘤细胞系为研究MGMT水平与胶质瘤对各种烷化剂的敏感性的相互关系提供了模型。虽然细胞培养模型对肿瘤治疗的作用宝贵，但这些模型并不能准确预测到临床上烷化剂细胞毒性作用或生物制剂对肿瘤细胞的反应。培养的细胞系，不一定准确反映原发肿瘤的生物学特征或异质性及其对治疗的反应。 2.2转基因小鼠模型转基因小鼠模型是通过转基因方法建立的动物模型，模型可以用作测试针对特别影响途径的治疗方案。例如，转基因小鼠被设计成能够涵盖多形性胶质母细胞瘤的关键遗传学特征(如EGFR突变)的模型，这类小鼠适合评价特别分子机制对治疗的影响。最近发现的条件性SV40 TAg转基因小鼠模型，可为不同生长期脑肿瘤发生过程的研究以及治疗措施的评价提供帮助，是一种重要的实验动物模型[12]。 2.3异种移植模型异种移植模型建立的细胞系往往发展成为皮下(异位)和头颅内(常位)的肿瘤。但是，利用已建立的胶质瘤细胞系进行原位移植，一般不能重建人类原发胶质母细胞瘤浸润性生长模式，相反，它们容易在注射部位形成实质性病变，压缩，而不是入侵实质细胞。此外，肿瘤细胞在培养基中的生长可能导致高度选择，造成重要的基因突变的丢失，这些基因突变原来普遍存在于原发性胶质母细胞瘤中，常见的如EGFR基因扩增[13]。虽然使用细胞异位移植对研究肿瘤生物学特征提供了一些帮助，但它最大的缺点是肿瘤发生是人为造成的(异种植入)，且生长于免疫抑制环境中(裸鼠)，缺乏肿瘤细胞与周围环境的相互作用，相对人类胶质瘤的发生发展仍存在较大差异。最近，一种可连续移植的裸鼠异种移植瘤模型被发现，这对于研究肿瘤的发生、发展过程，正确评价各种治疗方案和揭示生物学和临床关于耐药的机制等具有重要意义[14-15]。在这个模型下，胶质母细胞瘤组织样本从患者身上获得，并连续在无胸腺裸鼠的侧腹部增殖。这种传播方式允许保存其主要形态学和组织病理学的特征，如存在坏死，类似原发的胶质母细胞瘤的坏死。 3PARP抑制剂 PARP属于非组蛋白染色体蛋白质，目前已经被发现的家族成员有PARP-1、PARP-2、PARP-3、tankyrase-1、tankyrase-2、sPARP、vPARP等[16]。在生理情况下，PARP的功能是通过BER途径帮助修复单链DNA破裂，维持基因组的稳定。 在肿瘤治疗领域，临床前期模型研究表明，PARP-1抑制剂可以加强放疗和化疗药物的作用[17-22]，同时PARP-1抑制剂也表明单因子的作用能够抑制某些肿瘤细胞系[23-24]。AG-1436是PARP-1的一个强效抑制剂，在研究AG-14361对替莫唑胺细胞毒性的影响上，通过对2种遗传上匹配的基因进行研究：原代细胞系是MMR缺失，配对细胞系通过3号染色体的转让是MMR表达。结果，在MMR表达和MMR缺失的细胞系上，AG-14361都增加替莫唑胺的细胞毒性，但在MMR缺失细胞系上增幅更大(在MMR缺失细胞株中为3.7~5.2倍的增幅和MMR表达中为1.5~3.3倍的增幅比)。因为正常组织(特别是造血系统)中MMR表达，而肿瘤细胞可能是MMR缺失，所以在临床环境使用PARP抑制剂去增强烷化剂如替莫唑胺等的活性更能增强对肿瘤细胞的毒性作用。虽然PARP抑制剂提高了烷化剂药物对肿瘤细胞的毒性，但其可能会使烷化剂对正常组织的毒性显著增加。

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