清肺口服液拮抗呼吸道合胞病毒感染的血清药理学研究

作者：赵长江，袁斌，徐建亚，王莉，孔飞

【摘要】 目的 评价清肺口服液抗呼吸道合胞病毒(RSV)的活性。方法 采用MTT法，以利巴韦林为对照组，观察清肺口服液及不同给药方式对RSV的拮抗作用。结果 清肺口服液具有明显抗RSV的作用，与利巴韦林比较差异无统计学意义；清肺口服液的作用机制可能为抑制病毒吸附或增殖。结论 清肺口服液可以通过不同环节拮抗RSV病毒，是治疗RSV感染的有效复方制剂。

【关键词】 清肺口服液；呼吸道合胞病毒；中药血清药理学

Abstract：Objective To evaluate the anti-RSV activity of Qingfei Oral Liquid. Method With Ribavirin as the control， the antagonistic effect of Qingfei Oral Liquid and different administration methods on RSV infection were observed by MTT technology. Result Qingfei Oral Liquid had obvious effection of anti-RSV， showing no significant difference compared with Ribavirin. The action mechanism may be that Qingfei Oral Liquid has inhibition effects on adsorption or proliferating of RSV. Conclusion Qingfei Oral Liquid can antagonize RSV through different linkages. It is an effective compound preparation for treating RSV infection. Key words：Qingfei Oral Liquid；respiratory syncytial virus；serum pharmacology of traditional Chinese medicine 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)是引起婴幼儿病毒性肺炎和毛细支气管炎的主要病原体，约占婴幼儿肺炎病例总数的5%～40%，同时，也常引起成年人尤其是老年人的呼吸道感染，但目前尚无有效的预防和治疗方法。清肺口服液主要由炙麻黄、杏仁、葶苈子、虎杖等药物组成，临床研究取得了满意的效果[1]，但其作用机理尚未完全阐明。本实验欲从血清药理学方面对其做一探讨。

1 实验材料

1.1 动物

大耳白兔14只，雌雄不拘，健康无病，体重2.5～3 kg，南京市清凉山实验动物基地提供，合格证号：SCXK(苏)2007-0008。

1.2 细胞与病毒 人喉癌表皮细胞Hep-2，由凯基生物科技细胞中心提供，本实验采用第3～30代细胞。呼吸道合胞病毒B亚型(RSV B型)，博特生物有限公司提供。

1.3 试剂

DMEM(美国GIBCO公司)；新生牛血清(杭州四季青公司)；细胞培养液：DMEM加10%新生牛血清；细胞维持液：DMEM加2%新生牛血清；0.25%胰酶(美国GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物(MTT，AMERSSCO)；二甲基亚砜(DMSO，上海永华特种化学试剂厂)。

1.4 仪器

酶联免疫检测仪，EXL800型，美国BioTek；倒置显微镜， OLYMPUS BX-50。

1.5 药物及含药血清的制备

清肺口服液，南京中医药大学植物药研究中心提供，每剂含原药材10 mg/mL。含药血清的制备：清肺口服液给健康大耳白兔灌胃，剂量为48 g/(kg·d)，是临床等效剂量(12 g/kg)的4倍，每日分2次灌服，连续给药3 d。末次给药后禁食不禁水12 h，在家兔清醒状态下颈动脉采血，无菌分离血清，制成血清冻干粉-20 ℃保存备用。同时设空白对照，灌服等体积生理盐水，取血清方法同前。利巴韦林注射液：华北制药集团制剂有限公司产品，批号051202。

2 实验方法

2.1 分组

设含药血清组、空白血清组、利巴韦林组、病毒对照组及细胞对照组。

2.2 细胞培养

将复苏后的细胞以1×106/瓶接于25 mL培养瓶中，加入3 mL DMEM培养基。置37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞长至约90%后，用0.25%胰酶消化，进行传代培养。

2.3 病毒的扩增 待细胞在板或瓶中长满60%～70%后，吸去液体，加入适量(500～1 000 μL)病毒液，37 ℃、5%CO2培养箱中吸附2 h后，补维持液3 mL。逐日观察细胞病变(CPE，典型病变是融合的大泡)，病变达75%以上时收集病毒。

2.4 利巴韦林及含药血清最大无毒浓度测定 Hep-2细胞以1×105/mL浓度分种于96孔细胞板，每孔0.1 mL。待80%汇合后，以DMEM稀释清肺口服液含药血清和空白血清40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL 7个浓度，用维持液稀释利巴韦林2、1、0.5、0.25 mg/mL 4个浓度。弃去培养液，分别加入维持液稀释后的空白血清、含药血清和利巴韦林，每孔0.1 mL，正常细胞对照组加维持液，每孔0.1 mL。每个浓度4个孔。37 ℃、5%CO2培养箱中培养7 d，观察各组致细胞病变作用，测定不引起CPE的最低稀释度即最大无毒浓度，作为抗病毒实验的最高允许浓度。

2.5 呼吸道合胞病毒B亚型组织培养半数感染量的测定 Hep-2细胞以1×105/mL浓度接种96孔细胞板，每孔0.1 mL。用单培维持液10倍系列稀释病毒悬液，共8个浓度。每次稀释更换吸管以防止病毒滴度后延。在接种细胞后18～36 h内，细胞长成单层时吸弃培养液，PBS洗细胞面，接种系列稀释的病毒液，每个稀释度接种5孔，每孔0.1 mL，正常细胞对照孔加入0.1 mL维持液。37 ℃、5%CO2培养箱中吸附2 h，每15 min摇晃1次，使病毒均匀吸附。吸弃病毒液，每孔加入维持液0.1 mL，置37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养。逐日观察病变。以最高稀释度不再出现新病变时为终点，细胞病变程度用“-”～“++++”表示：无细胞病变时为“-”，≤25%细胞出现病变为“+”，＞25%～50%为“++”，＞50～75%为“+++”，＞75%为“++++”。根据Reed-Muench公式[1]计算病毒组织培养半数感染量(TCID50)。

2.6 加入血清的不同时间对病毒的抑制效应 将1×105浓度的Hep-2细胞接种到96孔培养板上，置37 ℃、5%CO2箱培养。待细胞长成单层，在18 h内吸弃培养液。a药物和病毒同时作用于细胞：将1 000 TCID50/50 μL RSV B亚型和清肺口服液含药血清(10 mg/mL)、空白血清(10 mg/mL)、利巴韦林(0.2 mg/mL)各50 μL分别混合，加入到含有细胞的培养板中。b药物作用细胞后感染病毒：先加入含药血清(5 mg/mL)、空白血清(5 mg/mL)、利巴韦林(0.1 mg/mL)各100 μL，12 h后弃去上清，每孔接1 000 TCID50/50 μL RSV B亚型，置37 ℃、5%CO2箱吸附2 h。吸弃病毒液，分别加入用2%维持液，每组5个复孔，每孔100 μL，置35 ℃、5%CO2培养箱。每日在倒置显微镜下观察细胞病变。72 h后加入MTT(用维持液稀释1 mg/mL)，每孔20 μL，置37 ℃、5%CO2培养箱，160 min后，小心吸弃上清，加入DMSO，轻轻振荡10 min，使结晶物充分溶解，选择490 nm波长在酶联免疫酶标仪上检测药物的细胞活性作用(OD值)，判断药物对细胞的保护作用[2]。

3 统计学方法

实验结果以x±s表示。应用SPSS11.5统计分析软件对实验数据进行统计学处理，采用方差分析。

4 结果

4.1 空白血清、含药血清和利巴韦林在Hep-2的最大无毒浓度测定结果

在Hep-2中，空白血清的最大无毒浓度为10 mg/mL；清肺口服液含药血清的最大无毒浓度为10 mg/mL；利巴韦林的最大无毒浓度为0.2 mg/mL。

4.2 呼吸道合胞病毒组织培养半数感染量结果

在Hep-2中，RSV B亚型(r6株)TCID50为10～4.83/50 μL。

4.3 清肺口服液对呼吸道合胞病毒的拮抗作用

(见表1)表1 清肺口服液对RSV B亚型致细胞病变的抑制作用(略)注：与病毒对照组比较，*P＜0.05；与空白血清组比较，#P＜0.05

5 讨论 上呼吸道感染的发生约90%由病毒引起，RSV是引起本病的主要病原之一。针对病毒感染，西医主要采用病毒唑为主的治疗，但尚存在一些问题：小剂量应用时治疗效果差，大剂量时会在红细胞中蓄积，对人体造成伤害。而现代研究显示，中药在防治病毒感染性疾病方面有一定的优势。由于以往经常采用中药复方粗提取物直接加入反应体系的方法，干扰因素大，不能反映药物在体内真实的代谢过程。而中药血清药理学在一定程度上避免了上述缺点，是研究中药复方的重要方法。

本实验结果表明，清肺口服液具有拮抗RSV感染的作用，与利巴韦林相比无明显差异，并且具有较高的安全性，以1∶4比例稀释后对正常细胞不表现出毒性作用。在此基础上，我们进一步研究了清肺口服液的可能作用环节，结果两种方法之间无明显差异，说明清肺口服液对RSV感染的不同环节均有一定的拮抗作用。由于血清药理学是一门年轻的学科，自身仍有许多不完善的地方，如目前血清中有效药物成分的药代动力学不清楚，不知何时是药物的最高血药浓度，从而导致采血时间难以确定。因此，我们借鉴了通用的方法[3]，即每日2次喂药，连续3 d，末次喂药后1 h采血。下一步我们将进行预实验，根据量-效关系，确定清肺口服液的最佳采血时间，以求实验的严谨性和科学性。